响应面法优化三叉苦黄酮提取工艺及抗氧化活性分析

罗桂花，林翠清，肖鸬华，方 媛，莫穗芬，杨惠琳，严 萍＊，詹若挺

（1.广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006，2.广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心 岭南中药资源教育部重点实验室（广州中医药大学） 国家中成药工程技术研究中心南药研发实验室，广东 广州 510006）

三叉苦[Melicope pteleifolia (Champion ex Bentham) T.G.Hartley]为芸香科蜜茱萸属植物，岭南本草著作《山草药指南》是对三叉苦最早记载的著作，主要作为地方药材被广泛应用，其用药部位广泛，包括枝、根、茎、叶。三叉苦又名三丫苦、三叉虎，主要产于我国广东、广西等地区[1]。据《中药炮制学词典》记载，三叉苦味苦性寒，有清解热毒,祛风除湿,消肿止痛之效。目前已经具有相关临床基础，市场上主要用于乳癖安消胶囊、三九胃泰、三九感冒灵等多种中成药。三叉苦中所含化学成分主要为黄酮类、生物碱类、挥发油、色烯等[2]，且三叉苦总黄酮具有较好的抗炎及抗氧化活性[3-4]。三叉苦作为广东省常用的药食同源植物，食用价值较高，已被广泛用于制作凉茶[5]。目前对于三叉苦提取的研究报道更多集中于抗炎作用[6]，为更好地开发利用三叉苦总黄酮类成分抗氧化作用，本实验采用星点设计响应面法对三叉苦总黄酮的单因素考察结果进行优化，并评价其体外抗氧化活性，为该药的开发研究提供基础。

1 仪器与材料

1.1 药材与试剂

所用药材于2016年3月采自广东河源，经广州中医药大学中药学院詹若挺研究员鉴定为芸香科蜜茱萸属植物三叉苦Melicope pteleifolia (Champion ex Bentham) T.G.Hartley的干燥带叶嫩枝。

芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100080-201409），供UV测定含量为92.6 %；无水三氯化铝（批号：K1505035，阿拉丁）；无水乙酸钠（批号：J1523067，阿拉丁）；冰醋酸（批号：H2004148，阿拉丁）；L-抗坏血酸（维生素C，批号：SLBS0712V，Sigma）；DPPH（批号：STBG8547，Sigma-Aldrich）；ABTS（批号：SLBK9616V，SIGMA）；过硫酸钾（K2S2O8，批号：L1509054，阿拉丁）；PBS pH 7.4缓冲液（批号：8120122，Gibco）。

1.2 仪器

摇摆式高速万能粉碎机（温岭林大机械有限公司）；万分之一分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；离子酸度计（pH计，Thermo）；紫外可见分光光度计（日本岛津）。

2 方法

2.1 三叉苦总黄酮提取方法比较

2.1.1 加热回流法 精密称取三叉苦药材粉末1 g置入锥形瓶，加入80 %乙醇溶液50 ml浸泡30 min后称重，加热回流提取30 min后补足失重，滤过，取续滤液即得三叉苦提取液。

2.1.2 超声提取法 精密称取三叉苦药材粉末1 g，置入锥形瓶，加入80 %乙醇溶液50 ml浸泡30 min后称重，超声提取30 min后补足失重，滤过，取续滤液即得。

2.2 三叉苦总黄酮回流提取工艺的优化

2.2.1 供试品溶液制备 精密称取三叉苦药材粉末1 g，置入锥形瓶，加入80 %乙醇溶液50 ml浸泡30 min之后称重，加热回流提取30 min后补足失重，滤过，取续滤液即得到三叉苦提取液。

2.2.2 对照品溶液制备 称取芦丁对照品适量，加入甲醇制成每1 ml含0.2 mg芦丁对照品溶液，取续滤液即得到对照品溶液。

2.2.3 显色条件 本实验检测三叉苦提取液中总黄酮含量主要采用三氯化铝-醋酸-醋酸钠缓冲溶液（AlCl3-HAc-NaAc）显色法[7]。精密移取1.0 ml供试品溶液，置入10 ml量瓶，分别加入0.1 mol/L AlCl3溶液和NaAc-HAc（pH 5.2）溶液1 ml，纯水定容后显色15 min，于415 nm波长处检测吸光值。

2.2.4 标准曲线的绘制 依次移取芦丁对照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 ml，转移至20 ml量瓶，按2.1.3项下方法显色测定。回归方程为y=1.2861x+0.0043，R2=0.9992，表明对照品溶液在4.00～24.00 μg/ml范围内，吸光度与浓度线性关系良好。

2.2.5 重复性试验 精密称药材粉末6份，按2.2.1项下进行制备，取1 ml，置入10 ml量瓶，按2.1.3项下显色后测定各溶液中的吸光度。

2.2.6 精密度试验 精密吸取2.2.1项下的总黄酮溶液1 ml，置入10 ml量瓶，显色后平行测定6次吸光度。

2.2.7 稳定性试验 精密吸取“2.2.1”项下的总黄酮溶液1 ml置入10 ml量瓶，显色后，于0，10，20，30，40，50，60，90，120，150，180 min测定吸光度。

2.2.8 加样回收率试验 精密吸取6份总黄酮含量已知的供试品溶液1 ml，加入芦丁对照品溶液适量，显色后测定吸光度。

2.3 三叉苦总黄酮的单因素试验

2.3.1 乙醇体积分数 按2.1.1项下制备方法，固定料液比为50:1、提取时间30 min，考查乙醇体积分数为50 %，60 %，70 %，80 %，95 %条件下的含量。

2.3.2 料液比 按供试品溶液制备方法，固定乙醇体积分数为70 %，提取时间30 min，考查料液比为10，25，50，75，100 ml/g条件下的含量。

2.3.3 提取时间 按供试品溶液制备方法，固定液料比为50 ml/g，乙醇体积分数为70 %，考查提取时间为15，30，60，90，120 min条件下的含量。

2.4 星点设计响应面法

使用Design Expert 12.0软件基于单因素考察的结果，以表1所列出条件为考察范围，采用星点设计进行三因素五水平的响应面试验，具体试验设计见表1。

表1 三因素五水平星点设计响应面试验表

2.5 体外抗氧化活性测定

2.5.1 三叉苦总黄酮对DPPH的清除能力 将三叉苦提取液旋蒸成浓缩液（1 g/ml）后用真空冷冻干燥机制成冻干粉，加90 %乙醇配成浓度为50，100，250，500，750，1000 μg/ml样品溶液，分别加入3.6 ml DPPH（0.2 mmol/L）溶液，混匀后避光静置30 min，于λ=517 nm波长处测定吸光度值[4]，按样品操作方法平行操作3次。

DPPH自由基清除率（%）=(A0-Ai)/A0×100 %

式中：A0为DPPH溶液与溶剂混合液的吸光度值；Ai为DPPH溶液与供试品溶液反应后的吸光度值。

2.5.2 三叉苦总黄酮对ABTS自由基的清除能力 将ABTS储备液（7.4 mmol/L）与K2S2O8储备液（2.6 mmol/L）等体积混匀后，避光、常温静置12 h，PBS稀释成吸光值0.7±0.02，即为ABTS工作液。

将三叉苦提取液旋蒸成浓缩液（1 g/ml）后用真空冷冻干燥机制成冻干粉，加90 %乙醇配成浓度分别为50，100，250，500，750，1000 μg/ml样品溶液，取0.8 ml ABTS工作液分别与0.2 ml不同浓度样品溶液混匀，常温避光静置6 min，测定734 nm处的吸光值[9]，按样品操作方法平行操作3次。

ABTS自由基清除率（%）=(A0-Ai)/A0×100 %

式中：A0为ABTS工作液与溶剂混合液的吸光度值；Ai为ABTS工作液与供试品溶液反应后的吸光度值。

3 结果与分析

3.1 总黄酮含量测定结果

加热回流及超声法提取结果比较表明，加热回流提取的含量测定结果比超声提取法高2.49 mg/g，为提高提取率，故选用加热回流作为提取方式。

重复性试验中吸光度的RSD为1.7 %，表明该方法重复性良好；精密度试验中吸光度的RSD为1.14 %，表明仪器精密度良好；稳定性试验中吸光度的RSD为1.72 %，表明总黄酮溶液在显色后180 min内稳定性良好；加样回收率试验中吸光度的平均加样回收率为103.64 %，RSD为1.63 %，表明该方法可用于总黄酮的含量测定。

3.2 单因素试验结果

3.2.1 不同乙醇体积分数的影响 乙醇体积分数对提取物中总黄酮含量的影响见图1。由图1可见，在一定浓度范围内，乙醇体积分数浓度的增加与三叉苦总黄酮含量成正比，当乙醇体积分数达70 %时，含量不再增加，此时含量最高为27.42 mg/g。浓度超过70 %后含量反而降低，可能与溶出杂质有关。因此选择乙醇体积分数为70 %为最佳条件。

图1 乙醇体积分数考察

3.2.2 液料比的影响 液料比对提取物中总黄酮含量的影响见图2。由图2可见，在一定范围内，液料比与总黄酮含量成正比，当液料比为75 ml/g时含量达到最高，超过之后不再增加。因此，液料比为75 ml/g时最佳。

3.2.3 回流提取时间的影响 回流提取时间对提取物中总黄酮含量的影响见图3。由图3可见，当液料比为75 ml/g，乙醇体积分数70 %时，对提取时间考察发现，30 min时总黄酮含量最高，30～120 min含量呈缓慢增加的趋势，最终120 min和30 min含量相近。可能因为黄酮类物质在加热前浸泡的30 min内已经大量溶出，使总黄酮提取较完全[10]。因此最佳回流时间确定为30 min。

图3 提取时间考察

综上，最佳提取条件为：乙醇体积分数70 %，液料比75 ml/g，提取时间30 min，在该条件下三叉苦总黄酮的提取率较高且较为节约能源。

3.3 响应面分析法试验结果

基于表1的设计因素水平，结合单因素试验考察结果，以总黄酮提取率（Y）为因变量，乙醇体积分数（A）、液料比（B）、提取时间（C）为自变量进行三因素五水平试验。

表2 星点设计响应面试验结果

将所得数据进行二次多项式回归拟合，得到的回归方程为Y=2.75+0.0883×A+0.0434×B+0.0439×C-0.0488×AB+0.0287×AC-0.0188×BC-0.0316×A2+0.0301×B2+0.0284×C2（R2=0.8648），拟合度良好，相关系数较高，方差分析中的模型P＜0.05，表明模型具有统计学意义；与此同时，失拟项P＞0.05，表明失拟项不明显。

响应面曲线的弯曲程度与该因素对响应值的影响成正比；曲线平滑则表明该因素影响不显著[8]。图4表明响应面起伏坡度较大，乙醇体积分数和料液比对三叉苦总黄酮含量测定的影响较大；图6可见响应面较为平缓，料液比和提取时间的交互作用较小。此结果与方差分析一致。因此乙醇体积分数的影响值大于液料比，液料比的影响值大于提取时间。

图4 乙醇体积分数和液料比对总黄酮含量的响应面图

图6 料液比和提取时间对总黄酮含量的响应面图

3.4 最佳提取工艺及验证试验

在以下范围内预测最佳提取条件：乙醇体积分数50 %～95 %，液料比10～50 ml/g，提取时间10～30 min。通过星点设计结合实验表明，当乙醇体积分数为90 %，液料比为10 ml/g，提取时间为30 min时为最佳组合因素。对上述条件进行验证发现总黄酮提取率实测值2.99 %，与预测值3.25 %偏差较小，表明模型能较好预测三叉苦中黄酮得率，认为该优化工艺较稳定可靠。

3.5 三叉苦总黄酮清除DPPH的能力

三叉苦总黄酮的DPPH自由基清除率见图7。由图7可见，当质量浓度为1 mg/ml时，三叉苦总黄酮的DPPH自由基清除率为47.11 %，三叉苦总黄酮清除DPPH的能力与质量浓度成正比。维生素C的IC50值为109.5 µg/ml，清除率可达90 %，表明三叉苦提取物除DPPH自由基的能力弱于维生素。

图7 三叉苦提取物对DPPH自由基清除率的影响

3.6 ABTS自由基清除能力测定

三叉苦醇提物的ABTS自由基清除率见图8。由图8可见，当质量浓度为100 μg/ml时，三叉苦醇提物的ABTS自由基清除率与维生素C相近，质量浓度增加至250 μg/ml则与维C的清除能力相当。结果表明，三叉苦提取物具有较好的清除ABTS自由基的作用。

图8 三叉苦提取物对ABTS自由基清除率的影响

4 结论

目前对于三叉苦响应面法设计的研究报道较少，三叉苦的黄酮类成分具有较好的抗氧化作用，本实验通过比较加热回流和超声两种提取方式，结果表明加热回流的含测值比超声高出2.49 mg/g，因此选择加热回流提取三叉苦总黄酮，并运用响应面法对提取工艺中常见的3个因素进行考察并优化，筛选出三叉苦总黄酮的最佳工艺。结果表明最佳条件为：乙醇体积分数90 %，液料比10 ml/g，提取时间30 min。按照此条件下三叉苦总黄酮含测值为27.57 mg/g，即总黄酮得率为2.99 %，与预测值3.25 %差距较小，表明星点设计建立的数学模型对实际的试验结果可拟合，表明该提取工艺有较强的可行性。

抗氧化活性相关测定试验表明，当三叉苦总黄酮提取物浓度达到250 μg/ml时，对ABTS的清除能力与维C相当，对DPPH的清除能力与浓度存在量效关系，表明其具有较好的抗氧化活性，可应用于开发功能食品或药品等。