利用廉价原料生产聚谷氨酸的研究

李海军，王庆波，张英华，郑德强，马双双，王 超

（1.山东福瑞达生物科技有限公司，山东 临沂 276700；2.山东福瑞达医药集团有限公司，山东 济南 250101；3.山东省药学科学院，山东 济南 250101）

γ-聚谷氨酸（γ-poly-glutamic acid，γ-PGA）是一种由微生物发酵将D-或L-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基结合形成γ-酰胺键的聚阴离子均聚多肽[1]。目前，γ-聚谷氨酸以其较好的缓释、成膜、乳化、保温、增稠等特点，广泛应用于食品[2]、药品[3]等领域中。但是由于聚谷氨酸的生产成本高，导致其价格昂贵，极大地限制了其应用[4]，其中最关键的是其发酵培养基的成本较高[5]。因此，寻找廉价的培养基原料生产聚谷氨酸的研究较多[6-10]。本文从聚谷氨酸发酵所需的氮源和碳源出发，分别研究小麦水解蛋白、豆饼粉、豆粕粉、玉米蛋白、玉米浆等有机氮源和甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、葡萄糖蜜、玉米糖蜜等碳源对聚谷氨酸发酵产量的影响，在此基础上通过单因素实验优化了玉米浆、硫酸铵、甜菜蜜、谷氨酸钠的添加量，最后通过发酵罐验证，比较优化后的聚谷氨酸发酵工艺与原有工艺使用蛋白胨、葡萄糖作为氮源和碳源的发酵水平。

1 材料与仪器

1.1 菌种

枯草芽孢杆菌（FRD518CGMCC NO.6772），本实验室活化保藏。

1.2 培养基

种子培养基：葡萄糖10g/L，谷氨酸钠10g/L，酵母粉5 g/L，MgSO40.25 g/L，K2HPO42 g/L，pH 7.5，115 ℃灭菌30 min备用。

发酵培养基：葡萄糖180 g/L，蛋白胨35 g/L，硫酸镁0.25 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，谷氨酸钠60 g/L，调节pH 7.5，115 ℃灭菌30 min备用。

1.3 仪器与设备

电子分析天平（Mettler Toledo）；ZHJHC1115B垂直流超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）；ZHWY-211B恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；LDZF-75KB-II立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；1200 Series高效液相色谱仪（Agilent Technologies）。

2 方法与结果

2.1 培养方法

种子培养：取一管冻存的种子（约1 ml）接入装有100 ml种子培养基500 ml三角瓶中，于37 ℃，250 r/min摇床震荡培养至A600达到1.8～2.2。

发酵培养：以5 %的接种量接种活化好的种子，温度37 ℃，250 r/min摇床振荡培养或350 r/min搅拌、10 L/min通气10 L发酵罐培养，发酵时间64 h，pH不控制，得聚谷氨酸发酵液。

2.2 分析、测定方法

γ-聚谷氨酸产量的测定使用QB/T5189-2017聚谷氨酸推荐的高效液相色谱法测定[12]，其中标准曲线的绘制及结果计算参见本标准。

色谱条件：色谐柱：TSK-gel G-3000PWXL凝胶色谱柱（7.8 mm×30.0 cm）；流动相：称取42.6 g无水硫酸钠，超纯水溶解并定容至1 L，用乙酸调pH至4.0，用孔径0.22 μm微孔滤膜过滤，超声波脱气15 min；检测柱温：30 ℃；检测波长：210 nm；检测器：紫外检测器；流速：0.5 mL/min；进样量：20 μl。

样品制备：称取2 g γ-聚谷氨酸发酵液，精确至0.001 g，用流动相溶解定容至100 ml。配好的试样溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤后进行高效液相色谱检测，记录峰面积，并根据标准曲线计算得到试样中γ-聚谷氨酸的浓度c。

2.3 发酵原料的选择与单因素优化

2.3.1 氮源选择 在配制发酵培养基时分别用35 g/L小麦水解蛋白、豆饼粉、豆粕粉、玉米蛋白、玉米浆作为氮源代替蛋白胨作为实验组，蛋白胨35 g/L作为对照组，其他培养基成分不变，研究廉价氮源添加代替蛋白胨对聚谷氨酸发酵产量的影响。

小麦水解蛋白、豆饼粉、豆粕粉、玉米蛋白、玉米浆、蛋白胨发酵聚谷氨酸的产量见表1。由表1可见，所选的廉价氮源中玉米浆的效果最好，但其发酵聚谷氨酸产量仍低于蛋白胨为氮源的产量。因此，可选取玉米浆作进一步优化。

表1 不同氮源类型发酵聚谷氨酸的产量

2.3.2 玉米浆条件的单因素优化 选择2.3.1项中筛选出的玉米浆分别加入20，25，30，35，40，45，50，55 g/L，作进一步的单因素优化。

玉米浆添加量对聚谷氨酸产量的影响，见图1。由图1可见，玉米浆添加量在20～40 g/L范围内，聚谷氨酸产量随玉米浆添加量增加而增加，玉米浆添加量40 g/L时达最大，为28.42 g/L；当大于40 g/L时，聚谷氨酸产量随玉米浆添加量增加而降低。因此，选取玉米浆加入量为40 g/L作进一步优化。

图1 玉米浆添加量对聚谷氨酸产量的影响

2.3.3 无机氮源的单因素实验 在微生物培养过程中，无机氮源与有机氮源总是相互配合发挥作用，无机氮源可满足前期微生物的快速生长，有机氮源则可满足微生物中后期生长及产物积累[11]。在无机氮源中，常用的是氯化铵和硫酸铵，由于使用氯化铵会增加发酵液中氯离子的含量，因此，选择硫酸铵作为无机氮源。在添加40 g/L玉米浆的基础上，分别加入0，2.5，5，7.5，10，12.5，15 g/L硫酸铵，通过单因素实验优化添加量。

图2为玉米浆添加量40 g/L时，聚谷氨酸产量随硫酸铵添加量的变化。由图2可见，硫酸铵从0增加至5 g/L时，聚谷氨酸产量从28.42 g/L增加至36.42 g/L，产量提高了28.15 %，与使用蛋白胨发酵聚谷氨酸产量相当；之后，硫酸铵继续增加至10 g/L时，聚谷氨酸产量变化不显著；在10 g/L以后，聚谷氨酸产量随硫酸铵添加量增加而逐渐降低。因此，选取硫酸铵加入量为5 g/L。

图2 硫酸铵添加量对聚谷氨酸产量的影响

2.3.4 碳源选择 在使用玉米浆40 g/L，硫酸铵5 g/L条件下，依据葡萄糖的加入量，分别使用同等质量的甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、葡萄糖蜜、玉米糖蜜代替葡糖糖，验证廉价碳源对聚谷氨酸发酵产量的影响，浓度和加入量及其聚谷氨酸的发酵产量见表2。由表2可见，不同来源的糖蜜其聚谷氨酸发酵产量不同，其中甜菜糖蜜的产量最高。因此，使用甜菜蜜代替葡萄糖作进一步优化。

表2 碳源浓度和加入量及其聚谷氨酸的发酵产量

2.3.5 甜菜蜜的单因素优化 分别加入200，250，300，350，400，450，500 g/L甜菜蜜，通过单因素实验，确定其最佳添加量。甜菜蜜加入量对聚谷氨酸发酵产量的影响，见图3。由图3可见，在200～350 g/L 范围内，聚谷氨酸产量随甜菜蜜加入量增加而增加，甜菜蜜加入量350 g/L 时达最大值，为39.82 g/L；之后，甜菜蜜继续增加，聚谷氨酸产量逐渐降低，因此选择甜菜蜜的加入量为350 g/L作进一步优化。

图3 甜菜蜜加入量对聚谷氨酸发酵产量的影响

2.3.6 谷氨酸钠的单因素优化 谷氨酸钠为聚谷氨酸合成的前体物质，当聚谷氨酸产量增加，谷氨酸钠加入太少就会影响聚谷氨酸的合成，因此对谷氨酸钠添加量进行了优化，分别加入40，50，60，70，80 g/L谷氨酸钠，通过单因素实验确定其最佳使用量。由图4可见，谷氨酸钠加入量为40～70 g/L时，聚谷氨酸产量增加，70 g/L达最大值；80 g/L时聚谷氨酸产量不再增加。选择70 g/L为最优条件。

图4 谷氨酸钠加入量对聚谷氨酸发酵产量的影响

2.4 聚谷氨酸产量的发酵罐验证

使用优化后的培养基玉米浆40 g/L、硫酸铵5 g/L、60 %甜菜糖蜜350 g/L、谷氨酸钠70 g/L为实验组，原有工艺葡萄糖180 g/L、蛋白胨35 g/L、谷氨酸钠60 g/L为对照组，其他培养基配方不变，进行10 L发酵罐验证实验。聚谷氨酸发酵产量与发酵时间的关系见图5。由图5可见，发酵初始时，对照组产量较高，可能是由于在初始时菌株可充分利用葡萄糖进行发酵，而糖蜜单糖含量较少，需分解为单糖才能被利用。最终实验组聚谷氨酸的发酵产量达45.34 g/L，高于对照组的产量40.46 g/L，产量提高了12 %。

图5 对照组与实验组聚谷氨酸产量与发酵时间的关系

3 讨论

本文从聚谷氨酸发酵所需的氮源和碳源出发，分别研究小麦水解蛋白、豆饼粉、豆粕粉、玉米蛋白、玉米浆等有机氮源和甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、葡萄糖蜜、玉米糖蜜等碳源对聚谷氨酸发酵产量的影响，在此基础上通过单因素实验优化了玉米浆、硫酸铵、甜菜蜜、谷氨酸钠的添加量，最后通过发酵罐验证，比较了优化后的聚谷氨酸发酵工艺与原有工艺使用蛋白胨、葡萄糖作为氮源和碳源的发酵水平。通过条件优化，最终通过发酵罐实验验证，表明当玉米浆40 g/L、硫酸铵5 g/L、60 %甜菜蜜350 g/L、谷氨酸钠70 g/L时，聚谷氨酸的发酵产量达到了45.34 g/L，高于原有工艺使用蛋白胨、葡萄糖的发酵水平40.46 g/L，产量提高了12 %。由于玉米浆的价格每吨约3000元，硫酸铵每吨约2000元，而蛋白胨每吨约2万元，综合其他生产费用，生产成本降低了20 %以上，有利于聚谷氨酸的推广应用。