中药苏木抑制胃癌活性组分鉴定及抑制效果研究

贺俊飞，杨喜花，，陈丽霞，赵莉莉，梁永琴，张生万*

（1.山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006；2.山西省肿瘤研究所 实验动物中心，山西 太原 030013）

0 引言

2019年国家癌症中心发布的数据表明，中国每年新发恶性肿瘤人次约380万，其中男性新发胃癌约47.8万，女性约12万。我国每年胃癌发病率以及死亡率，约占全世界的1/2，并呈上升趋势。虽然化疗技术有了很大的进步，但耐药性使得胃癌的预后效果仍然较差［1］。近年来从中药提取物中寻找新的抗肿瘤成分已成为癌症治疗的另一途径［2］。

据《中国药典》记载，苏木味辛性平，归心肝脾经，是豆科灌木或小乔木苏木的心材，中医上常用于治疗淤痛诸证［3］。最新研究发现，苏木（及其提取物）还具有降血糖、抗补体、抗炎［4］、抗氧化［5］、抗肿瘤［6］、抗菌［7］以及免疫抑制作用等新的药理活性［8］。已有研究证实苏木提取物对肝癌细胞株HepG2和Bel⁃7402的增殖抑制作用呈明显的剂量依赖性［9］；田甜等人研究发现苏木及苏木联合化疗可以抑制Lewis肺癌的生长，并可以抑制小鼠瘤细胞CD44、血清P⁃选择素等黏附因子的表达［10］。赵莉莉研究发现苏木提取物（巴西苏木素含量>50%）能有效抑制荷T24膀胱癌裸鼠移植瘤的生长，延长荷瘤动物生存期，并呈现一定的浓度依赖性［11］。

目前氟尿嘧啶注射（5⁃Fu）液为胃癌临床治疗常用化疗药，但其往往会对患者身体造成不同程度的损害，使得大多数患者不能按期完成化疗，从而影响治疗效果［12-13］。相比而言，中药苏木具有来源广泛、毒副作用小、价格低和抗肿瘤作用显著等优势［14-15］，但人们关于苏木发挥抗癌作用的活性组分及其具体抗癌效果等尚未报道。因此，本研究通过改变提取条件制备10个各组分含量各不相同的样品，通过考察各组分含量变化与细胞杀伤率的相关性，筛选其抗胃癌活性成分，并探究其对体内外肿瘤细胞的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与动物

BGC⁃823细胞株由山西省肿瘤研究所实验动物中心提供。

34只雄性BALB/c⁃nu裸小鼠，日龄35 d～40 d，体质量16 g～18 g，购自斯贝福（北京）实验动物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019⁃0010。动物的饲养及实验操作均在山西省肿瘤医院实验动物中心进行，实验动物使用许可证号为：SYXK（晋）2019⁃0003。实验期间动物自由饮水、进食。

1.1.2 试剂

RPMI⁃1640培养基，美国 Gibco公司；胎牛血清，美国Gibco公司；胰蛋白酶，Solarbio公司；甲醇：色谱纯，TEDIA；噻唑蓝（MTT），Solarbio公司；苏木（中药饮片），安徽盛海棠中药饮片有限公司。

1.1.3 仪器

Waters 1525高效液相色谱仪（配有2996 PDA检测器和Empower色谱工作站），美国Wa⁃ters公司；HR⁃40 II A2型生物安全柜，青岛海尔医用低温科技有限公司；SUNRISE酶标仪，奥地利Tecan公司。

1.2 方法

1.2.1 苏木提取物样品的制备

制备1-10号苏木提取物4号：将苏木饮片剪至长度约1 cm～2 cm，称取400 g，以料液比=1∶8加入3 200 mL蒸馏水于室温下浸泡1 h，加热电压为220 V，加热回流1.5 h（整个过程保持温度恒定），滤出提取液。按前述方法继续加蒸馏水提取4次，将5次提取液合并，充分混匀，减压浓缩到400 mL，于低温下（≤4℃）密封、避光保存24 h，过滤得滤液。用滤液2倍量的石油醚∶乙酸乙酯=2∶1混合液对滤液脱脂，同时充分搅拌（300 r/min，30 min），于分液漏斗中静置45 min后收集水相。使用水相体积2倍量的乙酸乙酯对水相进行萃取除杂2次，充分搅拌，于分液漏斗中静置45 min后合并有机相，用无水硫酸钠除去水分，在压力为0.08 MPa，温度不高于60℃的条件下旋蒸至无溶剂蒸出时得到苏木粗提粉［16-17］。取粗提粉加入粗提粉3倍量的蒸馏水溶解，负压抽滤，滤液处理同上述萃取除杂操作，负压旋蒸得到苏木精提粉。在其他条件相同的情况下，通过改变料液比、加热回流时间、加热回流次数、提取溶剂种类及其浓度等条件，制备得到10个苏木提取物样品。具体提取条件见表1。

1.2.2 高效液相色谱法（HPLC）测定苏木提取物中各组分含量

色谱条件：色谱柱：Agela Venusil XBP⁃C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相A、B分别为甲醇和0.2%的甲酸水溶液；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；梯度洗脱程序［18］：0 min～30 min：18%A，等度洗脱，30 min～50 min：18%～50%A，线性变化洗脱，50 min～55 min：50%A，等度洗脱；检测波长：285 nm。

1.2.3 苏木提取物体外对胃癌细胞BGC⁃823生长的影响

BGC⁃823细胞用常规培养方法传代培养［19-21］，选取对数生长期且生长状态良好的细胞（2～3代）用于实验。以每孔1×104个细胞接种至正常对照组和药物组各孔，空白对照组不加细胞。细胞培养过夜贴壁后，于超净工作台内轻轻吸弃培养基，给药组每组依次加入终浓度为25 μg/mL的10个苏木提取物样品溶液，对照组不加药。加药24 h或48 h后，将所有孔中的液体吸出，每孔加入100 μL MTT（0.5 mg/mL），放入培养箱中继续常规培养4 h，轻轻托起培养板，小心除去各孔上清，避光加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，于酶标仪中振荡10 min，使结晶充分溶解，在570 nm处测定各孔OD值。计算细胞生长抑制率。计算公式：

选择对细胞抑制作用最强即抗癌活性成分含量最高的苏木提取物作为后续实验的样品，将其分别配制成终浓度为6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的药物，干预胃癌细胞24 h，检测其对胃癌细胞增殖的抑制情况（MTT法），并计算其对胃癌细胞的半数抑制浓度（IC50）。IC50的计算公式为：

其中，Xm为lg最大剂量；I为lg（最大剂量/相邻剂量）；P为阳性反应率之和；Pm为最大阳性反应率；Pn为最小阳性反应率。

以上述苏木提取物对胃癌细胞的IC50为实验浓度，配制其浓度并分别干预细胞3 h、6 h、12 h、24 h、48 h，每个时间段干预结束后，通过细胞增殖情况（MTT法）的变化评价该浓度的苏木提取物在不同作用时间下对胃癌细胞的抑制效果。

1.2.4 苏木提取物对荷BGC⁃823胃癌裸鼠瘤体生长的抑制作用

选取对数生长期且生长状态良好的细胞（2～3代），经消化稀释后接种至裸鼠右腋皮下（1.2×107个/mL，0.1 mL），建模成功（接种部位出现长径约5 mm～7 mm的皮下结节）后进行后续实验［22-23］。

将建模成功、精神状态良好的30只裸小鼠随机分为模型组、阳性对照组（5⁃氟尿嘧啶注射液，125 mg/kg）、苏木提取物高、中、低剂量组（400、300、200 mg/kg）5组，每组6只动物。各组裸鼠均为瘤周皮下注射给药，其中苏木提取物组共给药8次（1次/2 d），模型组同时给予生理盐水（0.05 mL/10 g）；阳性药因其毒副作用大故每周给药1次，连续给两周，每次操作完成后均正常喂养。自接种日起，每天早晚各观察动物的精神、饮食、活动及大小便等一般情况1次；每隔1 d对裸鼠移植瘤瘤体长、短径（a、b）测量并详细记录1次，同时计算瘤体体积（TV）。计算公式：

实验结束后，取各实验组小鼠肿瘤组织（称重后快速于固定液中固定），计算肿瘤抑制率。计算公式：

1.3 统计分析

统计分析软件采用SPSS22.0，实验结果以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较时若方差齐时用LSD检验，若方差不齐时用Dunnett’s T3检验。非正态分布用非参数检验。

2 结果

2.1 苏木提取物中抗胃癌有效成分筛选结果

苏木提取样典型的液相色谱图如图1所示。将10个样品中均含有、且含量较高的7个组分进行相对含量分析，其结果见表2。

图1 苏木提取样典型的液相色谱图Fig.1 A typical liquid chromatogram of a sample extract from Sappan L.

表2 液相色谱测定各样品中主要组分相对含量结果Table 2 Results of relative content of main components in each sample determined by HPLC

由图2可见，提取样品中各种组分含量的变化与其对细胞杀伤率呈正相关者为保留时间14 min的组分（r=0.948，P<0.01）。该组分与图3巴西苏木素标准对照品出峰时间一致，可确定为巴西苏木素。

图2 苏木提取物各组分含量变化与细胞抑制率的相关图Fig.2 Correlation graph between the contents of each component and the cell inhibition rate of the extract from Sappan L.

图3 巴西苏木素对照品液相色谱图Fig.3 Liquid chromatogram of the Brazilin reference

2.2 苏木提取物体外对胃癌细胞BGC⁃823生长的影响

10份苏木提取物样品中巴西苏木素含量最高达55.74%，实验以该提取样品为研究对象（以下统称为苏木提取物）。由表3可见，各药物组细胞的生长均受到不同程度的抑制，且随着药物浓度的增加，细胞抑制率逐渐增加。当苏木提取物浓度为 12.5、25、50、100 μg/mL 时，细胞生长受到明显抑制（P<0.05），经计算得该提取物对胃癌细胞BGC⁃823的IC50为15 μg/mL。由图4可见，当苏木提取物对胃癌细胞的作用时间逐渐延长时，与正常对照组比较，细胞抑制率显著升高（P<0.05）。

图4 15 μg/mL的苏木提取物在不同作用时间下对细胞增殖的影响Fig.4 Effects of 15 μg/mL extracts from Sappan L.with different action time on cell proliferation

表3 苏木提取物不同作用浓度对细胞增殖的影响Table 3 Effects of extracts from Sappan L.of different con⁃centrations on cell proliferation

2.3 苏木提取物对荷BGC⁃823胃癌裸鼠皮下移植瘤体积和抑瘤率的影响

随着观察时间的延长，与空白对照组、阳性对照组和苏木提取物组小鼠相比，模型组小鼠活动逐渐减少，精神逐渐变差，饮水饮食逐渐减少；与苏木提取物组相比，阳性对照组小鼠饮水饮食减少，体重明显减轻，且身体呈弓背状，实验结束时有1只小鼠死亡。由表4可见，与模型组小鼠相比，苏木提取物组移植瘤生长速度均较慢，从小鼠接种后的第20天开始，高剂量组小鼠肿瘤平均体积显著减小（P<0.05），且两个组小鼠在实验末时的肿瘤抑制率分别为48.05%和63.92%。由表5可见，在实验末时，苏木提取物中、高剂量组小鼠瘤体平均重量显著低于模型组小鼠（P<0.05），且两个组小鼠抑瘤率分别为48.55%和60.86%。由此可知，苏木提取物可显著减小荷瘤小鼠移植瘤的体积和重量，并具有剂量依赖性，其中以大剂量效果最好。

表4 苏木提取物对裸鼠皮下移植瘤体积的影响（V/mm3，±s）Table 4 Effects of extract from Sappan L.on tumor volume of subcutaneous transplantation in nude mice（V/mm3，±s）

表4 苏木提取物对裸鼠皮下移植瘤体积的影响（V/mm3，±s）Table 4 Effects of extract from Sappan L.on tumor volume of subcutaneous transplantation in nude mice（V/mm3，±s）

注：*表示与模型组比较P<0.05。Note：*represents comparison with model group（P<0.05）.

第30 d 1 429±82 1 023±267*1 222±202 738±139*518±111*模型组阳性对照组苏木提取物低剂量组苏木提取物中剂量组苏木提取物高剂量组第10 d 102±8 93±17 98±29 83±24 61±17第15 d 345±104 204±14 236±41 222±10 81±12第20 d 774±143 393±61*712±16 387±60*111±57*第25 d 1 243±207 604±165*951±87 401±72*223±23*

表5 苏木提取物对裸鼠皮下移植瘤重量及肿瘤抑制率的影响（±s）Table 5 Effects of extract from Sappan L.on tumor weight and tumor inhibition rate of subcutaneous transplantation in nude mice（±s）

表5 苏木提取物对裸鼠皮下移植瘤重量及肿瘤抑制率的影响（±s）Table 5 Effects of extract from Sappan L.on tumor weight and tumor inhibition rate of subcutaneous transplantation in nude mice（±s）

注：*表示与模型组比较P<0.05。Note：Note ：*represents comparison with model group（P<0.05）.

动物数开始 结束组别模型组阳性对照组苏木提取物低剂量组苏木提取物中剂量组苏木提取物高剂量组66666 65666平均瘤重/g 1.235±0.352 0.904±0.423 1.131±0.361 0.636±0.173*0.483±0.077*肿瘤抑制率/%—26.77 8.40 48.55 60.86

3 讨论

恶性肿瘤在寻求高效治疗方法时，应尽可能规避各种致病因素（环境因素和遗传因素）。研究发现，高剂量、更长持续时间的吸烟会使胃癌的患病风险增加更为明显［24-25］，长期不良的饮食、作息习惯和过度饮酒也会使胃癌的患病风险增加。基于目前的医疗手段，胃癌治疗仍以手术切除治疗为主，化学治疗为辅，但该治疗方法存在着一定的弊端，如化疗药物对癌细胞杀伤缺乏靶向性，治疗后患者复发率高，以及毒副作用大。中药（含有抗癌活性物质）由于具有药性温和、毒副作用小、能增强机体免疫力、降低化疗副作用、减少复发及提高生存率的特点而备受关注［26］。中药苏木对体外肿瘤细胞的研究最早始于20世纪70年代的日本学者，随后国内也有其相关抑癌方面的报道。已有研究证实苏木醇提物对人肺癌A549细胞有明显的抑制作用，并呈浓度依赖性［16］；苏木水提取物对人卵巢癌SKOV3细胞株和荷SKOV3卵巢癌裸鼠有明显的生长抑制作用，且随药物作用呈现一定的浓度依赖性［17］；苏木提取液对人胃癌细胞株SGC⁃7901有明显的生长抑制及诱导凋亡的作用［27］，但关于苏木提取物中具体的抗胃癌活性成分及其体内抗胃癌效果的研究未见报道。鉴于山西省肿瘤研究所实验动物中心以苏木为主要原料研制的“苏复宁洗液”已成功用于膀胱癌的术后治疗，且临床效果良好。因此，开展中药苏木的抗胃癌作用研究，并将其开发为抗胃癌的临床用药具有重要的意义。

本实验研究表明，一定剂量的苏木提取物对体内外胃癌细胞均具有显著的抑制作用，其中起抑制作用的有效成分为巴西苏木素，为苏木提取物在临床胃癌化疗中的合理应用提供了实验理论基础。