基于网络药理学技术的肉苁蓉治疗便秘的分子机制研究

范毓慧 ，赵迪，刘欢乐，卫拂晓，秦雪梅*，刘晓节*

（1.山西大学 中医药现代研究中心，山西 太原 030006；2.山西大学 生物医药与大健康研究院，山西 太原 030006）

0 引言

随着人们饮食结构的改变、平均寿命的延长及精神心理疾病的增加，便秘的发生率逐年增高［1-2］。循证医学研究报道，我国便秘的发生率高达3%～11%［3］。便秘是临床上常见的消化系统疾病，主要由大肠的传导功能障碍引起。临床症状多见排便困难、粪便干结、排便次数减少及排便不尽等。便秘不仅会引起人体电解质紊乱，打破机体酸碱平衡，还会影响情绪，导致抑郁、烦躁、注意力下降等精神症状［4］。便秘产生的原因较为复杂，与脑-肠轴异常、Cajal间质细胞异常、激素和神经递质异常、排便动力学异常以及心理因素的影响等密切相关［5］。

西医对便秘的治疗常采用生物反馈疗法、药物疗法、手术疗法等［6］。西药虽然见效快，但有一定的副作用，而中医药在治疗便秘上具有得天独厚的优势，其疗效好、副作用少，而且有利于提高患者的依从性［7］。

肉苁蓉，列当科植物肉苁蓉（Cistanche de⁃serticola Y.C.Ma）或管花肉苁蓉C.tubulosa（Schenk）Wight的干燥带鳞叶肉质茎，其性温，味苦、咸，归肾、大肠经，具有补肾阳、益精血、润肠通便等功效［8］。在治疗老年功能性便秘中药处方中，肉苁蓉的使用率频率高达57.92%［9］，且肉苁蓉单味药及含肉苁蓉的中药复方药治疗便秘的临床疗效显著，但其治疗便秘的作用机制仍有待进一步研究［10-11］。

网络药理学应用多向药理学和系统生物学的思想，通过已有数据库探究药物靶点与疾病靶基因的相互作用，并构建关系网络，分析药物的作用机制，已成为中药研究的热门工具［12］。

本研究基于文献检索和数据库查询方式收集肉苁蓉的化学成分和作用靶点，运用网络药理学的方法对其进行归纳和整理，并通过生物信息学分析，构建“结构类型-活性成分-靶点-信号通路”网络，探讨肉苁蓉治疗便秘潜在的作用机制。研究结果将为肉苁蓉治疗便秘的临床应用提供理论依据，以期为进一步研究其作用机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件

中药系统药理学数据库与分析平台（TC⁃MSP，Traditional Chinese Medicine Systems Phar⁃macology Database and Analysis Platform）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php/）；PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；PharmMapper服务器（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html/）；UniProt数据库（http：//www.uniprot.org/uniprot/）；Gene⁃Cards数据库（http：//www.genecards.org/）；OMIM数据库（https：//www.omim.org/）；String数据库（https：//string-db.org/，Ver⁃sion11.0）；PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）；R软件clusterProfiler软件包、ggplot2软件包；chemBio3D ultra 14.0软件；Cytoscape3.7软件；AutoDock软件。

1.2 肉苁蓉化学成分的收集与活性成分的筛选

以“肉苁蓉”（Cistanches Herba）为关键词，在TCMSP中药系统药理学数据库与分析平台完成对肉苁蓉化学成分的检索。以口服生物利用度（OB，OB≥30%）和生物活性分子的类药性（DL，DL≥0.18）作为筛选条件，筛选肉苁蓉的活性成分。通过大量文献挖掘与整理获取已报道的肉苁蓉治疗便秘的潜在活性成分，一并纳入此次研究。

1.3 肉苁蓉治疗便秘作用靶点的筛选

在PubChem数据库中下载肉苁蓉活性成分的.sdf格式化学结构图，并利用ChemBio3D ul⁃tra14.0软件转化为.mol2格式，上传到Pharm⁃Mapper数据库，使用Select Targets筛选作用靶点。将所有成分得到的作用靶点取交集，作为肉苁蓉的成分靶点。在蛋白质数据库（Uni⁃Prot）中，应用“UniProtKB”功能检索上述成分靶点，得到其相应的官方名称（official symbol）。

以“Constipation”（便秘）、“Colonic Inertia”（结肠无力）、“Dyschezia”（大便困难）为关键词，利用OMIM数据库和GeneCards数据库筛选与便秘相关的基因靶点，并与肉苁蓉活性成分靶点取交集，得到肉苁蓉治疗便秘的潜在作用靶点。

1.4 肉苁蓉治疗便秘“活性成分-作用靶点”网络的构建

利用Cytoscape3.7.2软件构建肉苁蓉的活性成分与治疗便秘的作用靶点的可视化网络图。网络图中节点（node）表示肉苁蓉活性成分和作用靶点，边（edge）表示活性成分与作用靶点间的相互关联。

1.5 蛋白相互作用网络（PPI）构建与分析

将肉苁蓉治疗便秘的潜在作用靶点导入String数据库，基于String数据库获取靶点蛋白的交互作用信息。结果保存为TSV格式，并导入Cytoscape软件，对其进行网络分析，构建PPI网络。网络图中节点越大，颜色越红，代表度值（Degree）越大，该节点代表的靶点越重要，度值排名前5的靶点为肉苁蓉治疗便秘的重要靶点。

1.6 生物信息学分析

使用Bioconductor中的R软件包clusterpro⁃file对肉苁蓉的潜在作用靶点进行生物信息学分析。选择GO富集分析中的生物过程（Bio⁃logical Processes，BP）、细胞组分（Cellular Com⁃ponent，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）以及KEGG通路富集分析。选择物种为人（Homo spanies），设定阈值P<0.05，Q<0.05。按照涉及的靶点数目进行排序，使用R软件绘制条形图及气泡图，展示富集结果。

1.7 “结构类型-活性成分-靶点-信号通路”网络的构建与分析

将得到的肉苁蓉治疗便秘的潜在活性成分、作用靶点及信号通路，建立结构类型-活性成分、活性成分-靶点、靶点-信号通路的对应关系，然后导入Cytoscape软件构建可视化网络。使用Network Analyzer插件进行网络拓扑分析，筛选重要的活性成分及作用靶点。

1.8 成分-靶点分子对接分析

从PDB数据库中下载SRC与AKT1蛋白的3D结构，并使用PyMOL软件对蛋白质进行去水，氢化等处理。使用Auto Dock Tools软件，将处理好的蛋白质与其相对应的活性成分进行结合，结合能小于0说明配体与受体可以自发的结合。

2 结果

2.1 肉苁蓉活性成分的收集与筛选

通过TCMSP平台搜索“肉苁蓉”（Cistanch⁃es Herba），得到其化学成分共75个，以OB≥30%，DL≥0.18筛选得到6种化学成分。大量文献挖掘后，筛选出11种治疗便秘的潜在活性物质，共获得17种肉苁蓉治疗便秘的潜在活性成分（表1）。

表1 肉苁蓉潜在活性成分信息Table 1 Potential active components of Cistanche deserticola

2.2 肉苁蓉治疗便秘相关作用靶点的筛选

在Pharmmapper数据库中，以fit值大于2.5为筛选条件，共得到与肉苁蓉17个潜在活性成分相关的靶点3 876个。去除重复后将靶点导入Uniprot数据库，限定物种为人并校正为官方名称，共整合得到肉苁蓉潜在活性成分作用靶点415个。将上述靶点与OMIM和GeneCards数据库中筛选得到的便秘相关靶点取交集，得到肉苁蓉治疗便秘的潜在作用靶点共97个（表2）。

表2 肉苁蓉活性成分治疗便秘潜在靶点Table 2 Potential targets of the active ingredients of Cistanche deserticola in the treatment of constipation

2.3 “活性成分-作用靶点”网络构建与分析

将筛选得到的肉苁蓉治疗便秘潜在活性成分和作用靶点的信息导入Cytoscape软件，构建“活性成分-作用靶点”网络（图1）。该网络共包含114个节点（17个化合物节点、97个靶点节点）和938条边。网络图中的黄色矩形节点和绿色圆形节点分别代表肉苁蓉的活性和治疗便秘的作用靶点，边代表活性成分和作用靶点间的联系。从图1可看出，肉苁蓉的17个活性成分，通过KIT、IL2、SRC等97个靶点发挥治疗便秘的作用。拓扑分析结果表明，该网络中每个成分平均可与55.18个靶点相互作用，每个靶点平均可与9.67个成分相互作用。由此可以看出，肉苁蓉作用同一靶点可对应于不同的活性成分，不同的靶点也可以对应相同的活性成分。

图1 肉苁蓉治疗便秘“活性成分—作用靶点”网络Fig.1 “Active components-targets”network of Cistanche deserticola in the treatment of constipation

2.4 PPI网络构建与分析

在String数据库导入上述作用靶点蛋白，得到PPI网络关系数据，并使用Cytoscape软件对其进行可视化分析，绘制PPI网络图（图2）。该网络图中共有87个节点，426个边，其中节点表示蛋白，边表示蛋白之间的关联。在蛋白互作网络中，度（Degree）值排名前五的蛋白包括MAPK1（37）、AKT1（34）、SRC（32）、MAPK8（30）和EGFR（28）。因此，推测这些蛋白可能是肉苁蓉发挥药效的重要作用靶点。

注：节点的大小和颜色表示度的值，节点由小变大，颜色由黄变红对应的度值由小变大，边的粗细表示综合分数的值，边越粗综合分数值越大图2 肉苁蓉治疗便秘潜在作用靶点之间的相互作用网络Note：The size and the color of the node represent the values of the degree.The node from small to large，the color turns from yel⁃low to red，the corresponding degree value from small to large.The thickness of the side indicates the values of the combine score.The thicker the edge，the larger the combine score isFig.2 Network of interactions among potential targets of Cistanche deserticola in the treatment of constipation

2.5 生物信息学分析结果

GO富集分析共富集到1 741个GO条目，包括1 602个BP条目、29个CC条目和110个MF条目。应用R软件对BP、CC、MF基因富集数排名前10的条目绘制条形图（图3）。其中，在BP层面上，肉苁蓉对腺体发育、生殖结构发育、生殖系统发育、氧化应激反应、对类固醇激素的应答等影响较大。在CC层面上，肉苁蓉对细胞膜筏、膜微区、粘合斑、囊腔等影响较大。在MF层面上，肉苁蓉对蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、内肽酶活性、磷酸酶结合及蛋白磷酸酶结合等影响较大。

图3 肉苁蓉治疗便秘潜在作用靶点GO富集分析Fig.3 Gene ontology enrichment analyses of potential targets of Cistanche deserticola in the treatment of constipation

将KEGG富集分析得到的74条通路按照涉及的靶点数目多少排序，绘制前15条通路的气泡图（图4）。结果显示，肉苁蓉治疗便秘的作用靶点主要通过PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路、FoxO信号通路、Focal adhesion信号通路等途径发挥作用（图4）。

图4 肉苁蓉治疗便秘KEGG通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment of Cistanche deserticola for constipation

2.6 “结构类型-活性成分-靶点-信号通路”网络构建与分析

利用Cytoscape软件对前15条信号通路及其对应的作用靶点、活性成分及结构类型进行可视化分析（图5）。网络图中共有87个节点和722条边，其中度值（Degree）≥2倍的中位数的化合物如花生四烯酸（arachidonate）、苏齐内酯（suchilactone）、毛蕊花糖苷（acteoside）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）等通过与HRAS、AKT1、IGF1R、SRC、RAF1等关键靶点结合，作用于肉苁蓉治疗便秘的重要信号通路。从图5可以看出，肉苁蓉的活性成分作用于多个靶点，不同通路之间可通过多个共有靶点相互影响，协同发挥治疗便秘作用，体现了肉苁蓉多成分、多靶点、多通路治疗便秘的作用特点。

注：蓝色三角形节点代表结构类型；绿色菱形节点表示活性成分；粉色圆形节点表示潜在靶点；橙黄色箭头表示通路；边表示四者之间的相互作用图5 肉苁蓉治疗便秘“结构类型-活性成分-靶点-信号通路”网络Blue triangle nodes represent structure types，green diamond nodes represent active components，pink circle nodes represent potential targets，yellow arrows represent pathways；edges represent interactions among themFig.5 Network of "structure types-active ingredients-targets-signal pathways" of Cistanche deserticola in treating constipation

2.7 分子对接结果

PPI网络与“结构类型-活性成分-靶点-通路”网络筛选得到的前5个靶点均包含有AKT1与SRC，说明这两个靶点为肉苁蓉活性成分治疗便秘的重要靶点。将AKT1、SRC靶点与其相应的化合物进行分子对接（表3）。一般认为结合的构象越稳定，结合能越低，靶点蛋白与化合物发生结合的可能性越大。分子对接结果显示，与靶点AKT1结合较好的化合物有苏齐内酯、半乳糖醛酸，与靶点SRC结合较好的化合物有β-谷甾醇、苏齐内酯、（1R）-1-［［（2S，3R，11bS）-3-乙基-9，10-二甲氧基-2，3，4，6，7，11b-六氢-1H-吡啶并［2，1-a］异喹啉-2-基］甲基］-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并［3，4-b］吲哚-6-醇。选取与AKT1靶点和SRC靶点对接结果最好的化合物作图（图6）。

图6 苏齐内酯与AKT1和β-谷甾醇与SRC的分子对接模式Fig.6 Molecular docking patterns of suchilactone with AKT1 and β-sitosterol with SRC

表3 肉苁蓉活性成分与AKT1、SRC的分子对接结果Table 3 Molecular docking results of active components of Cistanche deserticola with AKT1 and SRC

3 讨论

便秘是一种临床常见的消化功能紊乱性疾病。中医理论认为便秘多为饮食不当、情绪障碍、年老体虚、感受外邪导致的大肠传导功能异常。与西医相比，中医药因其副作用小，疗效好且复发率低等特点，在治疗便秘上具有明显的优势。

中药肉苁蓉被誉为“沙漠人参”，是中医临床常用的补益类中药［13］。李时珍曰∶“此物补而不峻，故有从容之号”。肉苁蓉治疗便秘具有作用缓和、便而不泻的特点，长于虚性便秘的治疗。临床及动物实验研究均表明，肉苁蓉能有效改善便秘的症状［10，14-15］。本研究基于中药数据库、靶标预测技术、蛋白相互作用网络、网络分析平台的网络药理学研究模式揭示了肉苁蓉治疗便秘的作用机制。

本研究以OB≥30%，DL≥0.18为条件，利用TCMSP平台筛选出6种肉苁蓉潜在活性成分。查阅文献发现肉苁蓉的主要活性成分为苯乙醇苷类化合物，其中松果菊苷、毛蕊花糖苷含量较高，且为肉苁蓉的药典指标性成分。高云佳等［16］研究发现肉苁蓉中的总寡糖和半乳糖醇是其通便的药效物质。肉苁蓉中所含的糖类成分经分离纯化分析后，具有通便作用的糖类活性成分包括葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露醇、半乳糖醛酸等［16-19］。因此，本文将文献挖掘与整理获取的肉苁蓉活性成分与TCMSP数据库筛选出的共17个肉苁蓉潜在活性成分一并纳入研究。

“成分-靶点”网络分析表明肉苁蓉治疗便秘具有多成分、多靶点的作用特点。PPI网络分析结果显示，MAPK1、AKT1、SRC、MAPK8和EGFR为肉苁蓉治疗便秘的核心靶点。“结构类型-活性成分-靶点-信号通路”网络分析预测肉苁蓉治疗便秘的关键靶点可能为AKT1、SRC。AKT1蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要参与包括细胞凋亡、葡萄糖代谢等细胞过程［20］。孙宇等研究发现，降低慢传输型便秘大鼠的结肠组织中PI3K、AKTm⁃RNA及蛋白的表达可减轻其便秘症状［21］。SRC是一种酪氨酸蛋白激酶，激活SRC蛋白会导致PGE2释放而抑制Na+/K+-ATPase，从而改善便秘［22］。分子对接结果也表明，肉苁蓉中的大部分活性成分均能较好地与靶点结合，其中苏齐内酯（Suchilactone）与AKT1靶点结合效果最好，β-谷甾醇（β-sitosterol）与SRC靶点结合效果最好。

GO富集分析结果表明，肉苁蓉治疗便秘主要通过对腺体发育、生殖结构发育、生殖系统发育、氧化应激反应及对类固醇激素的应答等多种生物过程。KEGG通路富集分析结果显示，肉苁蓉主要通过 PI3K-Akt、Ras、MAPK、FoxO、Focal adhesion等信号通路治疗便秘。PI3K-Akt信号通路是细胞中重要的信号转导通路，可影响其下游多种效应分子（如TSC1/2、mTOR、FoxO、Caspase-9等）的活化状态，对细胞的增殖、凋亡起重要作用［23］。孙路强等研究显示肠神经胶质细胞（EGCs）可以通过分泌神经营养因子来降低PI3K-AKT蛋白的表达，并抑制PI3K-AKT通路的激活，从而改善肠道传输功能［24］。MAPK信号通路以一种保守的三级激酶模式为基础，参与细胞生长周期中的多种重要的生理/病理过程［25］。研究表明，慢性传输型便秘大鼠结肠组织中MAPKs表达水平与粪便含水量呈负相关［26］。上述研究结果表明PI3K-AKT、MAPK信号通路与便秘的发生、发展密切相关。Ras蛋白处于众多生长因子相关信号通路的上游［27］，可与黏着斑激酶（FAK）通过同多种效应蛋白作用，进而激活MAPK、PI3K-AKT等相关下游信号通路发挥效应［28-29］，这说明肉苁蓉活性成分可能通过作用于Ras，Focal adhesion信号通路，进而调节MAPK、PI3K-AKT等信号通路来治疗便秘。

本研究应用网络药理学对肉苁蓉治疗便秘的潜在活性成分、作用靶点、生物通路等进行了系统研究和分析。结果显示，肉苁蓉中的苏齐内酯、β-谷甾醇等17个潜在活性成分通过AKT1、SRC等 97个靶点调控PI3K-AKT、MAPK、Ras、FoxO和Focal adhesion等74条信号通路发挥其治疗便秘的作用。这充分显示出肉苁蓉通过一个复杂且高度动态的“成分-靶点-通路-疾病网络，发挥其多成分、多靶点、多通路治疗便秘的作用，为进一步深入研究肉苁蓉通便作用机制提供了理论依据。