长链非编码RNA SNHG1在子宫内膜癌中的表达及调控PI3K/AKT信号通路的研究

刘静雅，张海亮，李宝平，李 冲，郭初阳（咸阳市中心医院病理科，陕西咸阳 712000）

子宫内膜癌是全球常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，每年全球新发38万例，死亡8.9万例。近年来，我国子宫内膜癌的发病率也逐年上升，形势不容乐观[1]。尽管近年来子宫内膜癌的治疗取得了一定的进展，但患者的预后依然不容乐观[2]，因此探索新的治疗子宫内膜癌的靶点具有重要的研究价值。研究报道子宫内膜癌中检测出多种异常表达的长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA），其密切参与子宫内膜癌的发生和进展，可为寻找新型治疗方案提供方向[3-4]。长链非编码RNA 小核仁RNA宿主基因1（Long non-coding RNAsmall nucleolar RNA host gene 1,lncRNA SNHG1）在各种肿瘤组织中广泛表达，基础和临床研究均显示SNHG1在不同类型肿瘤中的致瘤性，密切参与结直肠癌、喉癌和肝细胞肝癌等多种肿瘤的发生发展[5-7]。ZHENG等[8]也在关于乳腺癌的报道中显示抑制SNHG1的表达可以减轻肿瘤的进展，其可能是新型的治疗靶点。而SNHG1在子宫内膜癌中的作用未知，本文对SNHG1在子宫内膜癌中的表达水平和功能进行了研究，为探究子宫内膜癌的新治疗靶点提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2013年1月～2014年6月入住咸阳市中心医院的54 例子宫内膜癌患者，其中＜50 岁者32 例，≥50 岁者22 例；组织类型：子宫内膜癌样腺癌44 例，非子宫内膜样腺癌10 例；分化程度：中高分化35 例，低分化19 例；FLGO分期：Ⅰ期22 例，Ⅱ期18 例，Ⅲ期14 例；子宫肌层浸润深度：＜1/2 者33 例，≥1/2 者21 例；无淋巴结转移者40 例，有淋巴结转移者14 例。患者出院后进行为期5年的随访，随访方式主要为电话或门诊，随访终点事件为患者死亡或随访时间结束。入组患者签署知情同意书，本研究通过伦理委员会审核。纳入标准：①所有患者均经临床病理确诊为子宫内膜癌；②均为初次诊断（入组前未进行任何治疗）；③有完整的随访记录。排除标准：①并发有心、肝、肾等重要脏器功能障碍者；②并发有其他恶性肿瘤者；③并发有血液系统、免疫系统疾病者。

1.2 试剂和仪器 反转录试剂盒购自美国Fermentas 公司；Trizol 裂解液购自美国Invitrogen 公司；SNHG1 和GAPDH 引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；子宫内膜癌细胞系Ishikawa 购于美国ATCC 细胞库；DMEM 高糖培养基和FBS 购于美国Giboc 公司；MTS 试剂购于美国Biovision 公司；细胞周期检测试剂盒购于上海BestBio-贝博生物科技有限公司；SNHG1 siRNA 购于广州锐博生物技术有限公司；Transwell小室购于美国Coring 公司；ECL 化学发光试剂盒购于美国Thermo 公司；强效RIPA 裂解液购于北京solarbio 公司；BCA 蛋白浓度检测试剂盒购于美国Thermo 公司；pPI3K 和pAKT 抗体购自美国Sigma 公司；PVDF 膜购于美国Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR：收集所有患者的肿瘤组织和癌旁组织（距离肿瘤边缘2cm 以上），剪碎研磨成粉末，采用Trizol 裂解液提取组织粉末或者细胞中的总RNA，再进行逆转录，得到cDNA，采用qRT-PCR 试剂盒以及7500 PCR 仪进行扩增反应，反应条件为：94℃5 s，95℃5 s，75℃30 s 共40 个循环。以GAPDH 为内参，GAPDH 引物F:5’-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3’，R：5’-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3’。SNHG1引物F：5’-CCCCATGATGGTTCCTCAGTT-3’，R：5’-GGAAAGCAAGTGCAGGTTAGTC-3’。SNHG1 相对表达量以2-ΔΔCt公式计算[8]。

1.3.2 细胞培养和转染：子宫内膜癌细胞系Ishikawa 复苏后将其置于DMEM-高糖培养液中，培养箱环境为37℃，5ml/dl CO2，每隔两天更换一次新鲜培养液。选取呈对数生长期的Ishikawa 细胞，采用胰酶进行消化，再种于6 孔板中，每孔1.5×105个细胞，分为对照组（si-NC）和实验组（si-SNHG1），接种12h 时采用脂质体2000 与无血清培养液混匀后，再分别与NC siRNA 和SNHG1 siRNA 混匀转染至各组细胞中，12h 更换为完全培养液[9]。

1.3.3 MTS 检测细胞增殖活性：Ishikawa 细胞呈对数生长期时将其铺至96 孔板中，2 000 个/孔，分为si-NC 组和si-SNHG1 组，设置5 个重复孔，按上述方法进行转染，48h 后每孔加入20μl 的MTS试剂，设置空白对照组，孵育2h 后检测各组细胞的A值。细胞增殖率=（A实验组－A空白对照组）/（A对照组－A空白对照组）×100%。

1.3.4 流式细胞仪检测细胞周期：胰蛋白酶消化收集转染siRNA 的各组细胞，1 000 r/min 离心5 min。无水乙醇固定细胞过夜后，按照细胞周期试剂盒说明书PI 孵育30 min 后，流式细胞仪检测各组细胞的周期细胞比例。细胞周期通过流式细胞术确定，FlowJo 软件进行定量分析[9]。

1.3.5 Transwell 实验检测细胞转移能力：收集转染siRNA 的各组细胞，计数1×105个重悬于100μl无血清培养液中，加入到Transwell 小室的上室，下室加入500μl 完全培养液。显微镜下进行观察，当细胞穿至下室10h 时终止培养，应用PBS 液冲洗上室细胞，甲醇固定10min，结晶紫染色后统计穿膜细胞数[8]。

1.3.6 Western blotting 检测蛋白表达：收集转染siRNA 的各组细胞，加入强效RIPA 裂解液，超低温高速离心机离心去除细胞碎片，BCA 试剂盒检测蛋白浓度，SDS-PAGE 电泳80V 分离蛋白，350mA 湿转2h，8g/dl 脱脂牛奶室温孵育膜1h，加入一抗，在4℃的环境下孵育过夜，加入二抗，在室温下孵育2h，采用ECL 试剂盒曝光条带。

1.4 统计学分析 用SPSS17.0 对数据进行分析。SNHG1 相对表达量等计量资料均以均数±标准差（±s）表示，采用t检验。此外，建立Kaplan-Meier 乘积限生存模型，以Log Rank 检验分析SNHG1 高表达和低表达患者生存率之间的差异。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SNHG1在子宫内膜癌组织中的表达水平 见图1。SNHG1在子宫内膜癌组织中的表达为1.61±0.79，高于癌旁组织中的表达（1.00±0.33），差异有统计学意义(t=5.236，P=0.000)。

图1 SNHG1在子宫内膜癌中的表达水平

2.2 SNHG1 表达与子宫内膜癌患者临床参数的关系 见表1。SNHG1的表达与子宫内膜癌患者年龄、组织类型和分化程度无关（均P＞0.05），与FLGO 分期、肌层浸润深度和淋巴结转移相关（均P＜0.05）。

表1 SNHG1 表达与子宫内膜癌患者临床参数的关系（n=54，±s）

表1 SNHG1 表达与子宫内膜癌患者临床参数的关系（n=54，±s）

类 别nSNHG1表达水平t 值 P 值年龄（岁）＜5032 1.59±0.70 0.259 0.796≥5022 1.64±0.69组织类型 子宫内膜癌样腺癌 44 1.62±0.61 0.224 0.823非子宫内膜样腺癌 10 1.57±0.75分化程度 中高分化35 1.60±0.45 0.151 0.881低分化19 1.63±0.80 FLGO 分期 Ⅰ～Ⅱ40 1.43±0.73 3.136 0.003Ⅲ14 2.12±0.64肌层浸润深度＜1/233 1.47±0.41 2.647 0.011≥1/221 1.83±0.59淋巴结转移 有14 1.92±0.66 2.289 0.037无40 1.50±0.32

2.3 SNHG1的表达水平对子宫内膜癌患者预后的影响 见图2。以SNHG1在子宫内膜癌组织中的表达水平1.61 为分界，＞1.61 为SNHG1 高表达（n=27），≤1.61 为SNHG1 低表达(n=27)，Kaplan-Meier 绘制生存曲线，结果显示SNHG1 表达高的患者5年生存率25.92%（7/27）低于表达低的患者5年生存率62.96%（17/27）。经Logrank检验，差异有统计学意义（χ2=33.266，P=0.000）。

图2 SNHG1的表达对子宫内膜癌患者预后的影响

2.4 SNHG1 siRNA 转染细胞效果 见图3。SNHG1在si-NC 组细胞中的表达为1.00±0.04，在si-SNHG1 组细胞中的表达为0.18±0.06，SNHG1 siRNA 可以抑制子宫内膜癌细胞系Ishikawa 中SNHG1的表达(t=27.854，P=0.000)。

图3 SNHG1 siRNA 转染Ishikawa 细胞效果

2.5 SNHG1 对子宫内膜癌细胞增殖活性的影响 见图4。si-NC 组细胞增殖率为100.00±4.21，si-SNHG1 组细胞增殖率为63.16±5.03，干扰SNHG1的表达后子宫内膜癌细胞Ishikawa 增殖活性降低，差异有统计学意义(t=13.757，P=0.000）。

图4 SNHG1 对子宫内膜癌细胞增殖活性的影响

2.6 SNHG1 对子宫内膜癌细胞周期的影响 见图5。si-NC 组G0/G1 期细胞所占比例为63.26±3.56，si-SNHG1 组G0/G1 期细胞所占比例为78.07± 4.32，干扰SNHG1的表达后子宫内膜癌细胞IshikawaG0/G1 期细胞增多(t=6.481，P=0.000)。

图5 SNHG1 对子宫内膜癌细胞周期的影响

2.7 SNHG1 对子宫内膜癌细胞转移能力的影响 见图6。si-NC 组细胞穿膜细胞数为49.31±8.34，si-SNHG1 组细胞穿膜细胞数为26.18±6.96，干扰SNHG1的表达后子宫内膜癌细胞Ishikawa 转移能力降低(t=5.216，P=0.000）。

图6 SNHG1 对子宫内膜癌细胞转移能力的影响（100×）

2.8 SNHG1 对子宫内膜癌细胞PI3K/AKT信号通路活化的影响 见图7。pPI3K 蛋白在si-NC 组和si-SNHG1 组细胞中的表达分别为1.00±0.02 和0.28±0.09，pPI3K 蛋白在si-NC 组和si-SNHG1 组细胞中的表达分别为1.00±0.05 和0.19±0.06。与si-NC 组相比，si-SNHG1 组细胞中PI3K/AKT信号通路的关键蛋白pPI3K 和pAKT 表达降低（t=19.129，25.404，均P=0.000）。

图7 SNHG1 对子宫内膜癌细胞PI3K/AKT信号通路活化的影响

3 讨论

子宫内膜癌是复杂的妇科恶性肿瘤，其发病率位居我国女性生殖系统恶性肿瘤的第二位[10]。子宫内膜癌起源于子宫内膜，其治疗主要以手术和放化疗为主，雌激素依赖型的I 型子宫内膜样癌患者通常在治疗后可获得较好的预后，而II 型非子宫内膜样癌是不依赖雌激素型，其更具侵略性，目前的治疗手段对该型具有局限性[11]。II 型非子宫内膜样癌和晚期复发转移的子宫内膜癌患者预后较差，5年存活率不足35%[2]。有研究报道吉非替尼、埃洛替尼和索拉非尼等分子靶向药物在对复发和转移的晚期子宫内膜癌患者的治疗呈现出较好的疗效，但是长期疗效和不良反应仍在进一步研究探讨中[12]，因此研究子宫内膜癌发生进展的分子机制，寻找新的靶向药物具有重要的临床意义。

LncRNA 是一大类不具有蛋白质编码能力的RNA，其特征为长度超过200 个核苷酸，并且缺乏可识别的开放阅读框，lncRNA 经常在人类癌症中表达失调，并且可作为致癌和癌症进展的关键调节因子[13]。lncRNA SNHG1 位于11q12.3 染色体上，在体内广泛分布，主要表达在细胞核和细胞质中，是一种促进肿瘤的lncRNA[14]。在结肠癌组织和细胞系中SNHG1 表达上调，且与肿瘤的恶性进展及预后不良有关，抑制SNHG1 表达后可抑制结肠癌细胞的增殖和迁移[5]。在喉癌组织中SNHG1 亦呈异常高表达，且实验发现，SNHG1 可通过调节Notch1 信号通路的活性影响喉癌细胞的增殖[6]。还有相关实验发现[8]，SNHG1 可通过促进上皮到间质细胞的转化促进乳腺癌的发生、发展，SNHG1基因敲除可抑制乳腺癌的增殖、迁移和侵袭。SNHG1在另一常见的生殖系统恶性肿瘤卵巢癌中亦起到促癌的作用，抑制SNHG1的表达后卵巢癌细胞的增殖能力明显下调[15]。越来越多异常表达的lncRNA逐渐在子宫内膜癌中发现[3-4]，但SNHG1在子宫内膜癌中的表达尚不清楚，本文采用qRT-PCR 检测发现SNHG1在子宫内膜癌中的表达水平显著增加，并与子宫内膜癌患者的FLGO 分期、肌层浸润深度和淋巴结转移相关，表明SNHG1 促进子宫内膜癌的进展。一项meta 分析显示[16]，SNHG1 表达水平升高与恶性肿瘤患者的总生存期和无进展生存期相关。本研究通过随访发现，SNHG1 表达高的患者5年生存率低于表达低的患者，提示SNHG1 高表达预示预后不良，其可能是子宫内膜癌患者不良预后的标志物。

以往研究报道显示SNHG1 与肿瘤的增殖和转移相关[17]。本文采用siRNA 干扰子宫内膜癌细胞中SNHG1的表达后，生物学功能实验同样显示抑制SNHG1的表达，子宫内膜癌细胞的增殖和转移能力降低，并且细胞周期阻滞在G0/G1 期。有研究报道干扰SNHG1的表达同样引起肝癌细胞和急性髓细胞性白血病的细胞周期阻滞在G0/G1 期[7,18]。PI3K/AKT 通路是调控肿瘤增殖和转移的重要途径之一，在子宫内膜癌中抑制PI3K/AKT 通路可以阻碍肿瘤的进展[19]。本研究结果显示，干扰SNHG1表达的子宫内膜癌细胞中，pPI3K 和pAKT的表达降低。ZHANG 等[20]的细胞实验也发现，在胰腺癌中SNHG1 通过调节PI3K / AKT信号通路促进肿瘤细胞的增殖。因此可以推测，SNHG1 可能是通过激活PI3K/AKT信号通路来促进子宫内膜癌细胞的增殖和转移。

综上所述，SNHG1在子宫内膜癌中表达增加，且其表达水平与FLGO 分期、肌层浸润深度和淋巴结转移有关，SNHG1 高表达的患者预后不良。干扰SNHG1的表达可能通过抑制PI3K / AKT信号通路降低子宫内膜癌细胞的增殖和转移能力。目前关于SNHG1 与子宫内膜癌的研究尚处于初级阶段，除调控PI3K / AKT信号通路之外，SNHG1 能否通过调节其他信号通路来促进子宫内膜癌的进展还有待更多的研究进行探索。