痛风性关节炎患者血清IL-1β，TNF-α，hs-CRP水平及与IL-1β基因启动子区rs2853550 A/G位点多态性相关性分析

叶科导，刘爱胜，施俊柱（1.深圳市龙华区中心医院a.内科；b.检验科，广东深圳 518110；.深圳市龙华区人民医院检验科，广东深圳 518109）

痛风性关节炎（gouty arthritis，GA）是由嘌呤代谢紊乱或尿酸（uric acid，UA）排泄障碍所导致单钠肿瘤坏死因子盐（monosodium urate，MSU）晶体沉积关节腔、滑膜及软骨等关节组织而引起一种晶体相关性关节炎，轻者可引起关节疼痛，重者可导致关节损害及肾功能衰竭，严重影响患者的生存质量[1-3]。GA 发作炎性机制至今尚未阐明，多数认为是单核/巨噬细胞吞噬沉积在关节及其周围组织中的MSU 结晶后，激活嗜中性白细胞碱性磷酸酶-3（neutrophil alkaline phosphatase 3，NALP3）炎症体，进一步激活白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白细胞介素-1 受体（interleukin-1 receptor，IL-1R），导致趋化因子、IL-18 等炎症因子分泌增加，从而导致GA 炎症反应[4-5]。同时IL-1β基因多个位点存在多态性，有研究表明，IL-1β基因rs2853550位点多态性与多种炎性疾病相关，其中与GA 相关性已见个别地区报道[6]，但基因多态性可能因不同地区人群的生活环境和习惯、遗传及免疫等诸多因素的不同而存在一定的差异。为此，本研究对深圳地区GA 患者和健康人群血清IL-1β，TNF-α，hs-CRP水平及与IL-1β基因启动子区rs2853550 A/G位点多态性相关性进行了对比分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018年7月～2021年2月在深圳市宝安区中心医院和深圳市龙华区中心医院内科门诊确诊的GA 患者216 例为GA 组，其中男性145 例，年龄26～59 岁，平均年龄38.53±12.78 岁；女性71例，年龄29～63 岁，平均年龄40.27±13.25 岁。纳入标准：①GA 患者均符合中华医学会内分泌学分会汇编的《中国高肿瘤坏死因子血症与痛风诊疗指南(2019)》[7]中GA 诊断标准；②初诊者；③诊断前未服抗GA 及其他免疫药物；④知情同意并积极配合者。排除标准：①患有感染性疾病者；②自身免疫疾病者；③伴有恶性肿瘤、结缔组织疾病及血液疾病者；④复诊者；⑤诊断前服过炎症抑制药物者；⑥服用过影响TNF-α水平的药物者；⑦肝、肾功能异常者；⑧孕妇及哺乳期者；⑨不配合者。同时选取健康体检人群153 例作为对照组，其中男性101 例，年龄25～61 岁，平均年龄39.74±13.02 岁；女性52 例，年龄27～65 岁，平均年龄41.75±13.98岁。对照组体检时均未见明显异常，均无自身免疫性、感染性及其它实质器官性疾病，同时3 个月内均未服用炎症抑制药及免疫药物。两组研究对象的年龄、男女比等一般性资料之间差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究已经同患者及家属知情同意，并经医院医学伦理委员会批准同意。

1.2 仪器与试剂 AU5800 全自动生化分析仪由美国Bankman 公司提供；IL-1β，TNF-α 试剂盒由默沙克生物公司提供；hs-CRP 试剂盒由深圳迈瑞公司提供；DNA 提取试剂盒由深圳亚能生物公司提供；ABI7500 PCR基因扩增仪由美国ABI 公司提供。

1.3 方法

1.3.1 收集标本： 采集清晨空腹静脉血2 份，其中1 份为EDTA-K2抗凝血，上下颠倒充分混匀，用于IL-1β基因rs2853550 A/G位点单核苷酸多态性分析；另外1 份为不抗凝血，室温静置30min 后离心分离血清，用于IL-1β，TNF-α及hs-CRP水平检测。

1.3.2 IL-1β，TNF-α 及hs-CRP水平检测：采用AU5800 生化分析仪比浊法对hs-CRP水平进行检测；IL-1β 和TNF-α水平采用酶联免疫吸附（ELISA）法进行检测。检测前对仪器进行保养、校正及质控检测，所有操作按仪器和试剂盒说明书进行，确保结果的准确性和可比性。

1.3.3 DNA 提取 ：采用DNA 提取试剂盒提取全血DNA，并将A260/A280比值在1.7～1.9 范围内的DNA提取物置于-20℃冰箱中保存备用。

1.3.4 IL-1β基因rs2853550 A/G位点多态性分析：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）法对IL-1β基因rs2853550 A/G位点多态性进行分析，具体操作参照文献[6]。

1.4 统计学分析 采用SPSS22.0 统计软件。正态或偏正态计量资料采用均值±标准差（±s）表示，两组比较采用t检验；计数资料采用率（%）表示，两组比较采用χ2检验；采用Spearman 进行相关性分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组IL-1β，TNF-α及hs-CRP水平比较 见表1。GA 组血清中IL-1β，TNF-α 及hs-CRP水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 两组IL-1β，TNF-α 及hs-CRP水平比较（±s）

表1 两组IL-1β，TNF-α 及hs-CRP水平比较（±s）

项目GA 组（n=216）对照组（n=153）tP IL-1β（pg/ml）5.16±1.023.94±0.874.217 3 0.030 4 TNF-α（pg/ml）21.84±6.493.50±1.16 20.510 4 0.000 9 hs-CRP（mg/L）17.03±5.612.14±0.73 23.274 5 0.000 7

2.2 Hardy-Weinberg 遗传平衡检验结果 两组患者IL-1β基因rs2853550 A/G位点多态性均检出AA，GA 和GG 三种基因型。经χ2检验，两组患者基因型和等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（χ2=1.107 5，0.902 1，P=0.081 2，0.102 7），抽样具有样本代表性。

2.3 两组IL-1β基因rs2853550 A/G位点基因型及等位基因频率比较 见表2。GA 组IL-1β基因rs2853550 A/G位点GG基因型及G 等位基因频率明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。GG基因型和G 等位基因患GA的相对风险明显增加（OR=7.092，95%CI：5.681～10.526 和OR=5.914，95%CI：3.514～8.029），而AA基因型和A 等位基因患GA的相对风险明显降低（OR=0.731，95%CI：0.576～0.918 和OR=0.584，95%CI：0.437～0.753）。

表2 两组IL-1β基因rs2853550 A/G位点基因型及等位基因频率比较[n（%）]

2.4 GA 组不同基因型患者IL-1β水平比较 GA组GG基因型IL-1β水平（5.42±1.12pg/ml）明显高于GA基因型（4.51±0.67pg/ml），而GA基因型明显高于AA基因型（4.04±0.29pg/ml），不同基因型之间差异有统计学意义（F=8.019 5，P=0.023 6）。

2.5 GA 组IL-1β 与TNF-α，hs-CRP水平相关性分析 GA 组血清IL-1β 与TNF-α，hs-CRP水平明显升高，经Spearman 相关性分析，IL-1β 与TNF-α，hs-CRP水平呈正相关（r=0.790 1，0.684 7；P=0.027 6，0.031 4）。

3 讨论

GA 是由过饱和的MSU 晶体沉积关节滑囊、滑膜、软骨及其他组织中，募集白细胞趋化并释放多种炎性介质所导致局部炎症反应的一种代谢性风湿病，好发于40 岁男性，男女比例为15:1。目前我国GA 发病率约为1%～3%，且呈逐年上升趋势，严重影响患者的生存质量和身心健康。但到目前为止，GA 发病病因和机制尚未完全阐明，近年来有研究表明，GA 发病与大量炎症细胞因子的释放有关[8-9]。IL-1β 是IL-1 主要分泌形式，主要由巨噬、单核及树突状等免疫细胞产生，是体内作用最强的炎症介质之一，与多种炎症性疾病的发病有关[10]。TNF-α是人体内免疫活性较强的一种细胞因子，是Toll 样受体4 信号途径的一种下游因子，可通过激活淋巴细胞和中性粒细胞，诱导和促进炎症其他相关因子的分泌，是炎症反应最重要的炎性细胞因子[11-12]。C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）是一种可溶性蛋白，由224 种氨基酸以5个相同的单体通过非共价键构成五聚体结构而发挥功能的，是全身炎症高度敏感的生物标志物，而hs-CRP 仅为一种以高敏手段检测血液中CRP水平的方法[13]。有研究表明，IL-1β，TNF-α 及hs-CRP水平与GA 发病有密切关系[5,14-15]。本研究结果显示，GA 组IL-1β，TNF-α 及hs-CRP水平比对照组明显升高，这验证了GA 发病可能与体内炎症细胞因子大量分泌和释放有关。此外，结果还显示，GA 患者IL-1β 与TNF-α 及hs-CRP水平之间存在不同程度的相关性，这可能与IL- 1β 被IL-1 受体识别并与之结合，激活IL-1 及核因子(NF)-B 信号通路，促进IL-1，IL-8 及TNF-α 等多种促炎症因子的分泌，引起炎症反应，从而导致hs-CRP水平升高有关[16]，同时也说明IL-1β，TNF-α 及hs-CRP水平在GA 发病中的作用基本是一致的。

GA 是由体内嘌呤代谢紊乱或尿酸（uric acid，UA）排泄障碍所导致的，但其具体发病机制至今尚未阐明，目前多数认为GA 是由环境和遗传因素共同作用所导致的一种复杂疾病，其中遗传因素在其发病过程中发挥了重要的作用。有研究表明，GA发生与多种基因多个位点多态性突变有关[17-19]。IL- 1β 是MSU 晶体诱导炎症反应的关键因子，而MSU 晶体是一种内源性损伤相关因子，可激活NLRP3 炎症小体，促进IL-1β 的成熟、分泌及释放，从而导致GA 的炎性反应。IL-1β基因多个位点存在多态性，有研究表明，IL-1β基因rs2853550位点多态性与炎症性疾病有关[6]。本研究结果显示，深圳地区GA 患者IL-1β基因rs2853550 A/G位点呈多态性，其中GG基因型患GA的相对风险明显增加，可能是该地区GA 发病的易感基因之一，而AA基因型患GA的相对风险明显降低，可能是该地区GA 发病的保护基因，说明IL-1β基因rs2853550A/G位点多态性可能与该地区GA 发病有密切关系。此外，结果还显示，IL-1β基因rs2853550 A/G位点不同基因型的GA 患者IL-1β水平存在很大差异，这表明IL-1β 可能通过其基因位点多态性突变影响其水平表达或导致其结构异常而在GA 发病过程中发挥作用，但具体作用机制有待深入研究。

综上所述，GA 患者血清中IL-1β，TNF-α 及hs-CRP水平明显升高，并存在一定相关性。同时IL-1β基因rs2853550A/G位点呈多态性分布，可能与GA 发病有密切关系，其中GG基因型患GA 相对风险明显增加，可能与深圳地区GA 发病有一定的相关性。