雷公藤甲素诱导肾癌细胞凋亡的研究

刘梦威 杨建霖 白明月 陈小刚

肾癌是最常见的十种癌症之一，占所有癌症的2%，且全球发病率呈上升趋势[1]。目前肾部分切除术是治疗临床分期T1a期肿瘤的标准治疗方法，而根治性肾切除术则是临床分期T1b～T4期肿瘤治疗的首选[2-4]。近年来，肾癌的治疗策略取得了一些进展，包括放疗、化疗及靶向治疗，然而大多数接受治疗的患者由于获得性耐药而发展为进展性疾病[5]。因此，阐明肾癌进展的分子机制至关重要，这可能有助于开发肾癌新的治疗策略与预后预测指标。

雷公藤是一种传统的中草药，属于卫矛科雷公藤属植物，其主要生物活性成分包括雷公藤甲素、萜类化合物、木脂素、糖苷和生物碱等。雷公藤甲素具有强大的抗肿瘤、免疫抑制和抗炎活性，在过去几十年里，雷公藤甲素因其独特的结构和丰富的药理活性在有机化学和药物化学领域引起了广泛的关注[6]。雷公藤甲素及其前体药物米奈尔内酯通过调控肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡在治疗各种人类肿瘤，包括实体和非实体肿瘤方面具有广阔的应用前景[7]。同时，通过设计和合成各种生物活性探针，确定了雷公藤甲素具有多种药理活性和毒性的分子靶点，其治疗潜力已进行了临床前评估，其临床应用有待进一步研究。

网络药理学是建立在系统生物学和网络生物学之上的一门新兴学科。在“疾病-靶点-药物”相互作用网络的基础上，揭示疾病治疗的潜在靶点，阐明药物的分子机制[8-9]。本文通过细胞实验结合网络药理学、分子对接和泛癌分析的方法，探究雷公藤甲素诱导肾癌细胞凋亡的作用靶点及分子机制。

材料与方法

一、细胞实验

雷公藤甲素购自MedChemExpress生物公司；血清、培养液、青霉素购自Thermo Fisher公司；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Annexin V-PI细胞凋亡试剂盒购自武汉恩格雅生物科技有限公司；ACHN细胞购自中国武汉典型培养物保藏中心；流式细胞仪购自美谷生物公司；酶标仪购自美谷分子仪器有限公司。

细胞活力检测：显微镜下观察细胞形态，选择对数生长期的肾癌ACHN细胞制成单细胞悬液，用细胞计数板计数。96孔板每孔接种8 000个细胞，在5% CO2、37 ℃细胞培养箱中孵育12～16 h。用培养液将雷公藤甲素分别配成浓度为25、50和100 nmol/L的混合液备用。弃去96孔板中原有培养液，加入25、50和100 nmol/L三种不同浓度的混合液设置为不同雷公藤甲素浓度的实验组，加入等量的二甲基亚砜设置为对照组，放进细胞培养箱孵育24 h后吸出药物培养基混合液。将90 μl无血清培养液与10 μl MTT溶液 (5 mg/ml)混合均匀制成MTT混合液后加入96孔板，细胞培养箱孵育4 h。待测孔中每孔加入100 μl 甲瓒溶解液，细胞培养箱继续孵育4 h。用酶标仪检测待测孔的吸光度(OD)值，计算细胞活力。

流式细胞术检测：显微镜下观察细胞形态，选择对数生长期的ACHN细胞，用细胞计数板计数后，6孔板每孔加入3×105个ACHN细胞，并加入培养液配成2 ml体系，放进细胞培养箱孵育24 h后，加入雷公藤甲素使每孔内的雷公藤甲素浓度为50 nmol/L并设置为实验组，加入等量的二甲基亚砜设置为对照组，放进细培养箱再培养24 h。收集药物处理完毕后的细胞，制成细胞悬液并对细胞进行计数。取5×105个细胞，4 ℃、300 g离心5 min。弃上清，将细胞团用1 ml预冷的PBS轻轻混匀，4 ℃、300 g离心5 min，弃上清，重复用PBS洗涤一次。用100 μl的Binding Buffer将细胞团混匀。在悬液中加入5 μl Annexin V-FITC染料与5 μl PI染液，轻轻混匀，室温避光条件反应15 min。在悬液中加入400 μl Binding Buffer混匀后用流式细胞仪检测，实验结果用Flowjo软件进行分析。

二、靶点的筛选

通过PharmMapper(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/)和Super-PRED(https://prediction.charite.de/)数据库进行雷公藤甲素靶点的筛选后取并集。使用UniProt(www.uniprot.org/)数据库对雷公藤甲素靶点信息进行规范化处理。在GeneCards数据库(http://www.genecards.org/)、治疗靶点数据库(therapeutic target database, TTD)(http://db.idrblab.net/ttd/)、孟德尔人类遗传数据库(online mendelian inheritance in man, OMIM)(http://omim.org/)和药物基因组学数据库(the pharmacogenomics knowledgebase, PharmGKB)(https://www.pharmgkb.org)中检索肾癌靶点，取以上数据库所得靶点的并集获取总靶点。利用Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)绘制韦恩图，获取雷公藤甲素-肾癌交集靶点。使用Cytoscape 3.8.0软件构建“雷公藤甲素-靶点-肾癌”网络。

三、蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络分析

将雷公藤甲素-肾癌交集靶点导入到String数据库(https://cn.string-db.org/)中进行PPI网络分析，得到PPI网络后利用Cytoscape 3.8.0进行可视化分析并筛选出雷公藤甲素-肾癌核心靶点。

四、基因本体论(gene ontology, GO)生物过程分析以及京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)信号通路富集分析

将雷公藤甲素-肾癌交集靶点上传至DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行GO和KEGG富集分析，在Image GP(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/)中作富集分析气泡图并将交集靶点富集的通路利用Cytoscape 3.8.0构建“通路-靶点”图。

五、分子对接

选取PPI中度值前14的核心靶点用于分子对接，通过Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载配体2D结构，在ChemBio3D 2019软件中优化并导出3D结构，在PDB(https://www.rcsb.org/)数据库中下载受体，再通过Pymol 4.6.0对蛋白质去水、去残基保存为PDB格式。在Autodock 1.5.7软件中进行分子对接得到结合构象，通过Pymol 2.5.2进行可视化处理。

六、泛癌及生存曲线分析

利用Sangerbox3.0(http://www.sangerbox.com/home.html)网站工具，对核心靶点进行泛癌分析研究。该网站从加州大学圣克鲁兹分校(university of california santa cruz，UCSC)(https://xenabrowser.net/)数据库中获得了核心靶点蛋白在肾乳头状细胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma, KIRP)、肾透明细胞癌(kidney renal clear cell carcinoma, KIRC)、肾嫌色细胞癌(kidney chromophobe, KICH)等三种肿瘤中的表达数据。利用该网站和R软件(版本 3.6.4)计算核心靶点在肿瘤组织与正常组织之间的表达差异，使用非配对威尔科克森秩和检验和符号秩和检验计算肿瘤组织和正常组织之间表达差异的显著性，P<0.01且表达倍数变化值≥2被认为差异有统计学意义。

我们利用基因表达谱交互分析(gene expression profiling interactive analysis， GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn/)数据库的单基因分析功能研究核心靶点的表达对KIRP、KICH、KIRC三种类型肾癌患者存活率的影响并绘制生存曲线。

七、统计学方法

应用SPSS 26.0统计学软件进行处理，正态分布的计量资料结果用平均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、细胞实验结果

如图1，不同浓度雷公藤甲素处理后的实验组ACHN细胞与对照组ACHN细胞相比，细胞活力均有所降低且细胞活力差异有统计学意义。随着雷公藤甲素药物浓度的增加，ACHN细胞逐渐丧失活力，当雷公藤甲素的浓度达到50 nmol/L时，ACHN细胞的活力明显下降。

A：不同雷公藤甲素浓度ACHN细胞活力的变化；B：在雷公藤甲素浓度为50 nmol/L时，实验组与对照组相比ACHN细胞的存活率(***表示P<0.001)图1 ACHN细胞24 h MTT实验结果

为探讨以上MTT实验结果，我们采用Annexin V-FITC和PI双染色检测对照组与实验组(雷公藤甲素浓度为50 nmol/L)ACHN细胞的凋亡。如图2，位于右下象限的细胞为单独阳性属于早期凋亡，位于右上象限的细胞为双阳性属于晚期凋亡。以上结果证实雷公藤甲素剂量依赖性地降低肾癌ACHN细胞的活力并诱导细胞凋亡。

A：对照组与实验组ACHN细胞的凋亡实验；B：对照组与实验组早期凋亡、晚期凋亡与总凋亡之间的差异(**表示P<0.01)图2 ACHN细胞24 h凋亡实验结果

二、雷公藤甲素及肾癌靶点的筛选及可视化分析

在PharmMapper数据库和Super-PRED数据库分别获取到282个和132个雷公藤甲素相关靶点，对以上靶点取并集后获得总靶点396个，使用Uniprot数据库对雷公藤甲素靶点信息进行规范化处理后导入Cytoscape 3.8.0软件构建“雷公藤甲素-靶点”网络，该网络有397个节点，396条边。在OMIM数据库中获得肾癌靶点111个，TTD数据库中获得肾癌靶点60个，Pharm-GKB数据库中获得肾癌靶点29个，GeneCards数据库中以“相关度≥10”为筛选条件获得肾癌靶点1 219个，对以上数据库所得靶点取并集获得肾癌总靶点1 283个。利用韦恩图获取雷公藤甲素-肾癌的交集靶点共126个。利用Cytoscape 3.8.0软件构建“肾癌-靶点-雷公藤甲素”网络，该网络有142个节点，209条边(图3)。

注：绿色多边形表示肾癌，圆形节点表示共同靶点，蓝色三角形表示雷公藤甲素，边表示相互作用图3 “肾癌-靶点-雷公藤甲素”网络

三、PPI网络的建立及核心靶点的筛选

将交集靶点导入String数据库中，设定物种为“人类(Homo sapiens)”、置信度≥0.900，除去未参与相互作用的靶点得到PPI网络。以“中心度值≥中间值0.003 178 506，亲中心度值≥中间值0.4，度值≥2倍中间值12”为条件筛选核心靶点并利用Cytoscape 3.8.0软件进行可视化分析，该网络显示核心靶点之间存在相互作用且连接紧密。按度值从大到小进行排序，位列前5的靶点为PIK3R1、MAPK1、SRC、STAT3和HSP90AA1。其中度值定义为该靶点与其他靶点的连接数，该指标反映了靶点在网络中的关键程度。

四、GO、KEGG富集分析

使用David 6.8数据平台对126个交集靶点进行GO富集分析，GO分析对生物过程(biological process, BP)、细胞组分(cellular component, CC)和分子功能(molecular-function, MF)进行了富集。GO-BP共有83条通路，选取20条通路做气泡图(筛选标准为P值<1e-10，图4A)；GO-CC共有58条通路，选取20条通路做气泡图(筛选标准为P值<1e-4，图4B)；GO-MF共有98条通路，选取20条通路做气泡图(筛选标准为P值<1e-5，图4C)。GO-BP富集分析结果显示交集靶点富集于“凋亡过程的负调控”，这表明雷公藤甲素与细胞凋亡过程密切相关。

A：GO-BP富集分析；B：GO-CC富集分析；C：GO-MF富集分析(条形图的长度和气泡的大小表示富集靶点的数量，颜色越深表示P值越大)图4 GO富集分析图

KEGG通路富集分析共获得160条通路，以P值<1e-16，错误发现率<1e-15为筛选条件选取排名前20的通路。20条通路共有543个靶点，对删除重复项后剩余的78个靶点绘制KEGG信号通路富集分析图，该网络有98个节点，542条边(图5)。KEGG富集分析结果表明核心靶点主要富集于PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路、癌症中的蛋白聚糖信号通路和Ras信号通路。

A：KEGG富集分析气泡图，条形图的长度和气泡的大小表示富集靶点的数量，颜色越深表示P值越大；B：富集通路-靶点图，圆形节点表示靶点，蓝色矩形表示前20个富集通路图5 KEGG富集分析图

五、分子对接结构

对PPI中度值前14的核心靶点进行分子对接并可视化处理，其中RHOA、HRAS、EGFR与雷公藤甲素有4条氢键连接，SRC、MAPK14、ESR1、AKT1、NFKB1与雷公藤甲素有3条氢键连接(图6)，这表明雷公藤甲素与核心靶点的结合较稳定。

A、B、C、D、E、F、G、H分别表示雷公藤甲素与RHOA、HRAS、EGFR、SRC、MAPK14、ESR1、AKT1、NFKB1靶点结合的3D结构，左侧背景大分子代表核心靶点，右侧放大的小分子代表雷公藤甲素，黄色虚线代表氢键图6 雷公藤甲素与核心靶点的分子对接结构

六、泛癌及生存曲线分析

针对PIK3R1、MAPK1、SRC、STAT3和HSP90AA1的泛癌分析提示这5个靶点在肾癌组织与正常组织中的表达具有显著差异，表明这5个靶点在肾癌中具有重要的生物学作用。生存曲线分析表明PIK3R1、MAPK1、HSP90AA1高表达与SRC、STAT3低表达肾癌患者的预后较好(图7)。

A、B、C、D、E分别表示PIK3R1、MAPK1、SRC、STAT3、HSP90AA1蛋白的泛癌分析图和生存曲线图，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.000 1，核心靶点蛋白高表达标示为红色，核心靶点蛋白低表达标示为蓝色图7 泛癌分析图与生存曲线图

讨 论

雷公藤甲素是一种从中草药雷公藤中提取的二萜三氧化二酯，具有抗炎、免疫抑制和抗肿瘤作用[10]。近年来有研究表明雷公藤甲素在多种癌症包括肾癌、前列腺癌、乳腺癌和结肠癌中可以诱导癌细胞凋亡，其中肾癌相关的研究表明其可诱导肾癌细胞周期阻滞和凋亡，具有成为肾癌新治疗药物的潜力[11-13]。

本研究通过对肾癌ACHN细胞的细胞活力及细胞凋亡检测发现雷公藤甲素可诱导ACHN细胞凋亡。通过网络药理学和分子对接技术推测雷公藤甲素诱导肾癌细胞凋亡的核心靶点蛋白为PIK3R1、MAPK1、SRC、STAT3和HSP90AA1等，主要的信号通路为PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路、癌症中的蛋白聚糖信号通路和Ras信号通路。研究表明，PIK3R1在肾癌中表达下调，尤其是在晚期肾癌和转移性肾癌中。PIK3R1的下调促进了肾癌细胞的增殖、迁移和上皮-间质转化并获得干细胞样表型，同时可能通过激活PI3K/AKT/GSK3b/CTNNB1通路促进肾癌的进展和转移，而上调PIK3R1的表达可以促进肾癌细胞的凋亡[14]。MAPK1是MAP激酶家族的成员，在丝裂原信号转导途径中起着关键作用，是MAPK级联的重要组成部分，通过调节MAP激酶信号通路可诱导肾癌细胞凋亡，对治疗肾癌具有重要意义[15]。PI3K-AKT信号通路经证实可以通过下游哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)有效地抑制肾癌细胞的增殖、迁移、侵袭并诱导细胞凋亡，同时也可以通过下游细胞周期蛋白D(cyclin D)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)等靶蛋白使细胞周期阻滞，是当前被广泛认可的肾癌治疗通路[16-17]。MAPK信号通路包含4个不同的级联通路且MAPK信号通路广泛表达，在细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和分化等许多生物过程中发挥关键作用[18-19]。同时，GO-BP富集分析的结果显示雷公藤甲素与肾癌细胞凋亡的过程密切相关。泛癌与生存曲线分析表明PIK3R1、MAPK1、SRC、STAT3和HSP90AA1这5个核心靶点蛋白在KIRP、KIRC、KICH中与正常组织中的表达有显著差异，并与肾癌患者的存活率存在相关性。

综上，本文通过对肾癌ACHN细胞的细胞活力检测及细胞凋亡检测发现雷公藤甲素可以诱导肾癌ACHN细胞凋亡，并通过网络药理学、分子对接、泛癌和生存曲线推测雷公藤甲素可能与PIK3R1、MAPK1等核心靶点蛋白稳定结合，通过PI3K-AKT、MAPK等信号通路诱导肾癌细胞凋亡，提高肾癌患者的存活率，这为后续相关实验验证及临床应用提供了理论参考与支撑。