右旋柠檬烯对双酚A影响下人源乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤生长及肠道菌群的影响

陈雨然，伍庆华，罗 琪，罗黎明，彭雨蒙，曾艳清，徐 磊，李龙雪，洪 滔，刘志勇

(江西中医药大学，330004，南昌)

0 引言

乳腺癌2020年乳腺癌病例数达226万人，首次超过肺癌，约占新发癌症病例的11.7%，已成为威胁女性健康的重大公共卫生问题[1-2]，在乳腺癌的发病原因中，外源雌激素的作用不可小觑，Epstein[3]等证实了雌激素可以直接或间接地刺激人乳腺癌细胞的增殖，促进啮齿类动物乳腺癌的发生。双酚A(bisphenol A，BPA)是一种具有外源性拟雌激素样作用的双酚类化合物(bisphenols)[4]，与乳腺癌的发生有一定关系，研究发现双酚A通过雌激素相关受体γ促进三阴性乳腺癌细胞的迁移和侵袭[5]，其中的三阴性乳腺癌由于早期和术后的主要治疗方法单一[6]，患者的临床结局较差[7-8]更值得研究，尝试筛选来自芳香药食两用中药材中的右旋柠檬烯来拮抗外源雌激素导致的肿瘤增长，选择三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231，观察环境雌激素双酚A影响下，右旋柠檬烯作用于MDA-MB-231细胞的增殖及荷MDA-MB-231乳腺癌裸鼠的肠道微生物生物多样性变化，为开发新型抗三阴性乳腺癌药物奠定基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器

CO2恒温培养箱(MCO-18AC，Panasonic)，超净工作台(SW-CJ-1FD，苏净安泰)，XDS-18生物倒置显微镜(重庆水电仪器总公司)，DM0412离心机(DLAB)，沪02270113血球计数板(上海求精生化)，注射器(南昌进贤3L医疗)。

1.2 试剂

HL15(Hyclone, SH300048.01)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum)(S601S-500，Sera&Pro)，胰酶Trypsin(0457，Amresco)，PBS(SH30256.01，Hyclone)，Matrigel(356234，BD)，β-Estradiol(E8875，Sigma)。

1.3 实验动物

5周龄雌性Balb/c-nu/nu小鼠30只，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号为SCXK(湘)：2019-0004。随机分成右旋柠檬烯低剂量+双酚A，右旋柠檬烯中剂量+双酚A，右旋柠檬烯高剂量+双酚A，双酚A 组和肿瘤组。

1.4 受试药品及配制方法

右旋柠檬烯,由本实验室从兴国九山生姜提取纯化。准确吸取药物100 μL(低剂量)、200 μL(中剂量)、400 μL(高剂量)，滴加PEG-400定容至2 mL。双酚A配制，准确称取2.7 mg，40 μL DMSO溶解后，滴加环糊精溶液(2-羟丙基-β-环糊精，0.3 g/mL)，稀释定容至13.5 mL，0.2 mg/mL。

1.5 方法

1.5.1 人源乳腺癌 MDA-MB-231细胞培养 人源三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培养液中，收集指数生长期的细胞，无血清HL15重悬至适合密度(5×107/mL，1:1添加Matrigel)用于接种小鼠皮下肿瘤接种。

1.5.2 肿瘤细胞的接种 裸鼠每只按200 μL的量于右前肢侧腋下接种1×107MDA-MB-231细胞，接种后定期观察裸鼠生长情况和肿瘤生成情况，待皮下接种处肿瘤生长至平均体积100 mm3时，根据所荷肿瘤大小和小鼠体重按1.5.3方法随机进行分组，并给予相应药物。

1.5.3 随机分组 由于肿瘤体积大小会影响药物治疗的有效性作出判定，所以采取Excel帮助的随机分组设计的方法，即将鼠所荷肿瘤体积的值输入Excel表中进行分组，以保证不同组别间的肿瘤体积的差异尽可能小。在给药治疗前，称体重，并用游标卡尺测量荷瘤鼠的肿瘤体积。

1.5.4 雌激素干预 细胞接种前1天开始(接种当天不干预)，每天定时于小鼠瘤旁(右前肢腋下)皮下注射β-雌二醇溶液100 μL(β-雌二醇0.6 mg/mL)。

1.5.5 给药 分组当天按照实验设计方案开始给药。

1.5.6 实验观察和数据收集 MDA-MB-231细胞接种腋下后，观察裸鼠生长及药物治疗对实验鼠日常行为的影响，包括荷瘤裸鼠的活动状况、摄食和饮水情况、体重变化、眼睛、口鼻、裸鼠整体外观及其它是否有异常情况，及时记录观察到的临床表现。口服右旋柠檬烯后，每周2次用游标卡尺对乳腺癌肿瘤的的长径(L)和短径(D)进行测量，肿瘤体积(mm3)= 1/2 ×(肿瘤长径 × 肿瘤短径2)。

1.5.7 实验终止和肿瘤标本收集 末次给药后24 h终止喂养实验，麻醉小鼠后对荷瘤状况及离体瘤块进行拍照，对肿瘤进行称重，并计算肿瘤抑制率 =(模型组瘤重均值-实验组瘤重均值)/模型组瘤重均值 ×100%)，肿瘤组织随后保存于-80 ℃冰箱；粪便采集，小鼠处死后取结肠内粪便装冻存管立即液氮保存，后转移-80 ℃冰箱。

1.6 粪便基因组DNA的获取和扩增

对粪便基因组DNA采用 SDS 方法进行提取，提纯的DNA的纯度和浓度用琼脂糖凝胶电泳检测，符合要求的样本DNA以无菌水稀释至1 ng/μL，并以此为模板，基于测序区域的选择，用带 Barcode 的引物，新英格兰生物技术公司的PCR混合体系和高效高保真酶进行PCR，引物为16S V4区(515F和806R)。PCR产物用琼脂糖凝胶(2%)进行电泳检测，依据PCR产物浓度进行等量混样，再次检测PCR产物，目的条带回收产物后使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒构建文库，获得文库经过Qubit和Q-PCR定量合格后，NovaSeq6000进行测序。

1.7 测序后下机数据的处理

测序后下机数据根据Barcode和PCR扩增引物序列拆分各样本结果数据，截去引物序列后对每个样本的reads进行FLASH(V1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)拼接，得到Tags数据(Raw Tags)，并经严格的过滤处理得到高质量的Clean Tags。参照Qiime(V1.9.1，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的Tags质量控制流程，进一步筛掉小于Tags长度75%的Tags，通过与物种注释数据库(https://github.com/torognes/vsearch/)进行比对，最终去除嵌合体序列获得有效数据(Effective Tags)。

1.8 样本复杂度分析(Alpha Diversity)

物种多样性通过使用Qiime软件(Version 1.9.1)计算，Alpha多样性指数组间差异分析应用R软件进行分析，差异分析采用wilcox进行检验。

1.9 菌群物种的相对丰度展示

对OTU进行菌群物种分类，并分别在门、纲、目、科、属、种几个分类等级对各个样品做物种丰度柱状图，就可以直观看出不同物种在每个样品中所占的比例，选取每个分组在门水平和属水平上丰度排名前十的物种，生成菌群物种相对丰度柱形累加图，比较各样本在相应分类水平上，物种丰度较高的菌群和它们的比例。

1.10 物种丰度聚类热图

以颜色的深浅梯度来代表数据矩阵中数值的大小和物种、样品中丰度相似性进行聚类的Heatmap，加上样品的处理信息，可以直观观察到相同处理的聚类情况，并能直接反映样品的群落组成的相似性和差异性。本分析根据丰度排名前35的属，结合每个样本中的丰度和注释信息构建Heatmap，从物种和样本2个层面进行聚类分析。

2 实验结果

2.1 肿瘤的抑制情况

荷瘤鼠肿瘤体积逐渐增加，其中双酚A 组的肿瘤体积增加始终高于对照组和右旋柠檬烯各组，右旋柠檬烯给药后随剂量的增加，肿瘤体积减小，高剂量组与对照组、双酚A 组比较，具有显著性差异(P<0.01)。

图1 右旋柠檬烯对双酚A环境下荷MDA-MB-231乳腺癌肿瘤裸小鼠肿瘤体积的影响

图2 右旋柠檬烯对双酚A环境下荷MDA-MB-231乳腺癌肿瘤裸小鼠瘤重的影响

2.2 样本复杂度分析(Alpha Diversity)

Chao指数和Ace指数是生态统计学中用来估计群落中含OTU数目的2种指数。Chao指数和Ace指数越高，表明样本中的菌类总数越多。由图3可知，接种肿瘤后细菌种类下降，右旋柠檬烯治疗后肠道菌群种类增加。

D组为右旋柠檬烯低剂量组，E组为右旋柠檬烯中剂量组，F组为右旋柠檬烯高剂量组，G组为双酚A组，H组为对照组，下同。

Shannon、Simpson可以用来表示群落丰度的情况，Shannon指数越大，代表生物样本的菌落多样性越高；反之Simpson指数越大，代表群落多样性越低(图4)。结合2种指数可以看出，荷瘤裸鼠肠道群落丰度下降，双酚A及同时给与右旋柠檬烯后群落丰度有所增加。

图4 荷瘤小鼠及右旋柠檬烯治疗后Shannon指数和Simpson指数

2.3 基于OTU的Venn图

根据不同样本(组)之间共有、特有的OTUs聚类，得到OTUs韦恩结果图，可见其中5个组共同拥有的OTU为269个(图5)，5个相关处理组各自特有的OUT情况为D组(右旋柠檬烯低剂量组)为38个，E组(右旋柠檬烯中剂量组)占37个，F组(右旋柠檬烯高剂量组)占342个，G组(双酚A组)占205个，H组(对照组)为37个。

每个椭圆形代表一个样本处理组，椭圆形和椭圆形重合部位的数字代表各实验组之间共有的OTUs个数，无重合部位的值代表各组的特有的OTUs个数。

2.4 物种相对丰度展示

以门水平物种相对丰度柱形图为例展示如图6，对食用右旋柠檬烯后的小鼠肠道细菌进小鼠肠道粪便中共检测到10个菌门，包括拟杆菌门Bacteroidet、疣微菌门Verrucomicrobiota、芽孢杆菌Bacilli、厚壁菌门Firmicutes、γ变形菌门Gammaproteobacteria、弯曲杆菌门Campylobacteria、放线菌门Actinobacteriota、α变形菌门Alphaproteobacteria、放线菌门Coriobacteria。5组粪便样品中所含的细菌门中拟杆菌门Bacteroidet、疣微菌门Verrucomicrobiota、芽孢杆菌Bacilli、厚壁菌门Firmicutes占到了总细菌的75%以上，右旋柠檬烯中高剂量组疣微菌门菌verrucomicrobiota丰度较双酚A 组和对照组的明显增多，而拟杆菌门Bacteroidet丰度较双酚A 组和对照组的明显减少。

图6 荷瘤小鼠及右旋柠檬烯治疗后门水平肠道菌群物种相对丰度柱形图

以属分类水平进一步分析裸鼠粪便样品中肠道细菌群落的结构，发现采集的样品(直肠粪便)中共涉及来源于10个属的细菌群落，见图7。其中拟杆菌属Bacteroides、异戊酸杆菌Alloprevotella、阿克曼氏菌Akkermansia、乳杆菌Lactobacillus、螺杆菌属Helicobacter、毛螺旋菌属Parasutterella、Erysipelatoclos属、脲原体菌Ureaplasma、毛螺菌科NK4A136组Lachnospiraceae_NK4A136和未注释菌属Others。与对照组相比，双酚A及右旋柠檬烯处理组拟杆菌属Bacteroides、异戊酸杆菌Alloprevotella、阿克曼氏菌Akkermansia、乳杆菌Lactobacillus、螺杆菌属Helicobacter、毛螺旋菌属Parasutterella差异较大，但未达到显著性意义。

图7 荷瘤小鼠及右旋柠檬烯治疗后属水平肠道菌群物种相对丰度柱形图

2.5 菌类物种的丰度聚类Heatmap图

根据各组的属分类水平的物种丰度和相关注释信息，选取菌类丰度排名前30的属，绘制成Heatmap热图8。

图8 荷瘤小鼠及右旋柠檬烯治疗后肠道菌群物种丰度聚类热图

3 讨论

一些药食两用类药材可能具有新颖的抗肿瘤作用机制且副作用小。例如生姜在之前的研究中发现具有很好的消炎抗肿瘤作用，为三阴性乳腺癌治疗药食两用类药物的开发提供了可能性[9-11]。

肠道菌群通过与宿主形成微生态系统密切影响着宿主的生理病理过程，近年来肠道菌群与肿瘤关系的研究得到了关注，Goedert[12]等提取48例绝经后乳腺癌患者与健康绝经后妇女粪便中肠道菌群DNA，经illumina 测序和16S rRNA基因分类发现，绝经后乳腺癌患者粪便中肠道菌群的多样性和组成差异少，肠道菌群中Clostridiaceae(梭菌)，Faecalibacterium(粪杆菌属)，Ruminococcaceae(瘤胃菌科)的丰度明显增高，Dorea(多尔氏菌科)和Lachnospiraceae(毛螺菌科)的丰度则降低。其中α-多样性和β-多样性发生了大幅度下降。实验发现经右旋柠檬烯治疗的毛螺菌科NK4A136组Lachnospiraceae_NK4A136与对照和双酚A 组比较有所增加，由于肠道菌群的不同组成导致个体间的抗肿瘤免疫的差异可能是主要环境因素，这种肠道菌群的不同可能影响全身免疫，进而通过调控宿主免疫影响肿瘤免疫治疗的效果及毒副反应，干预肠道菌群(如益生菌、粪菌移植等方法)，有望成为辅助肿瘤免疫治疗的重要手段。