丁香油与月桂酸对金黄色葡萄球菌的协同抑制作用

2022-03-07谭婉静张笑薇白泓李晓凤余以刚肖性龙

现代食品科技 2022年2期

谭婉静，张笑薇，白泓，李晓凤，余以刚，肖性龙

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

金黄色葡萄球菌在自然环境中广泛存在，是最常见的食源性致病菌之一。污染金黄色葡萄球菌的食品，不仅保质期缩短，误食后还可能引起食物中毒。为了抑制食品中致病菌、腐败菌等微生物的生长，延长其保质期，添加防腐剂是食品生产企业的首选。随着化学防腐剂弊端的出现，以及人们对绿色、安全食品的追求，使用安全、有效的植物源天然防腐剂已成为食品保鲜的趋势[1，2]。许多天然防腐剂如精油、酶、壳聚糖等已经被用于食品保鲜[3]。从植物的不同部位提取出来的植物精油，长期以来一直被用作食品调味剂，并被美国食品和药物管理局认定是安全的[4，5]。丁香油等精油被证明能够有效灭活微生物，维持食品品质，延长保质期[6，7]。中链脂肪酸（medium chain fatty acid，MCFA）是一组天然存在于椰子油、棕榈油和牛奶等食物中的甘油饱和脂肪酸酯[8，9]。在 MCFA 中，月桂酸及其酯类被证明是食品和化妆品中最有效的抗菌剂[10]。尽管精油和中链脂肪酸有很多优点，但单独使用时要想达到理想的保鲜效果，仍需要大量添加。对精油和中链脂肪酸联合使用进行抑菌的研究发现，两种化合物联合时对大肠杆菌具有协同杀菌作用，此时所需的抑菌物浓度更低且效果更好[9]。

生鲜米粉在我国历史悠久[11]，因其风味独特、易于消化，在东南亚大部分地区都很受欢迎[12]。然而，水分含量高、营养丰富，使生鲜米粉很容易受到微生物的污染[13]。因微生物增殖导致保质期的缩短，限制了生鲜米粉产业的发展[14]。因此，控制生鲜米粉中微生物的生长对延长其保质期尤为重要。

革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌具有不同的细胞结构，中链脂肪酸和精油联合对革兰氏阳性菌是否具有协同作用尚未被研究，且二者联合在食品中的作用尚未被证实。本文选择金黄色葡萄球菌作为模式菌，探究丁香油、百里香油、薄荷油等三种植物精油以及中链脂肪酸月桂酸对金黄色葡萄球菌的抑制效果，并筛选出具有协同抑制作用的组合丁香油与月桂酸，测定协同组合对金黄色葡萄球菌生长、细胞膜通透性的影响。此外，还将协同组合丁香油与月桂酸制成抑菌保鲜液用于生鲜米粉保鲜，通过测定生鲜米粉中的微生物及理化性质，并进行感官鉴评，评价该抑菌保鲜液对生鲜米粉的保鲜效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生鲜米粉，购买自当地生鲜超市；胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）、大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA），购买自广州环凯微生物有限公司；平板计数琼脂，购买于青岛高科园海博生物技术有限公司；丁香油、薄荷油，购买自安徽酷尔生物工程有限公司；百里香油，购买自江西雪松天然医药油有限公司；月桂酸，购买自国药控股化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

LRH-250A-2恒温培养箱，韶关市泰宏医疗器械有限公司；HZQ-F100恒温振荡培养箱，哈尔滨市东联仪器有限公司；TYXH-1旋涡混合器，上海兰仪实业有限公司；YXQ-LS-100SⅡ高压蒸汽灭菌锅，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；SW-CJ-1SD超净工作台，苏州尚田洁净技术有限公司；SORVALL Stratos台式高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技有限公司；BCD-256KFA冰箱，山东青岛海尔股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌悬液的制备

用接种环蘸取保存于-80 ℃甘油管中的金黄色葡萄球菌，在TSA平板上划线，于37 ℃恒温培养箱中倒置培养 24 h。随后用接种环挑取单菌落接种于 40 mL TSB培养基中，在37 ℃、180 r/min恒温震荡培养箱中震荡培养，活化菌株。无菌环境下吸取生长到指数期的菌液1 mL接种于40 mL TSB中，37 ℃、180 r/min恒温震荡培养箱中震荡培养至稳定期，取菌液于8000 r/min条件下离心5 min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤 2次，最后重悬于无菌 TSB溶液中得到 106CFU/mL菌悬液。

1.3.2 抑菌剂母液的制备

月桂酸母液：称取适量月桂酸固体颗粒，用50%乙醇水溶液溶解，用0.22 μm有机系滤膜过滤除菌后加入无菌水稀释至576 μg/mL，此时乙醇浓度为25%，37 ℃水浴锅保存备用。

丁香油、薄荷油、百里香油母液：吸取适量精油原液，用50%乙醇水溶液溶解，用0.22 μm有机系滤膜过滤除菌后加入无菌水分别配制成512 μg/mL、512 μg/mL、480 μg/mL的丁香油、薄荷油、百里香油母液，此时乙醇浓度为25%，37 ℃水浴锅保存备用。

1.3.3 最小抑菌浓度（MIC）的测定

三种精油及月桂酸对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（Minimum inhibition concentration，MIC）的测定参照Purkait等[5]所描述的方法。按照1.3.1所述制备菌悬液，1.3.2的方法配置三种精油及月桂酸母液。在96孔板中每孔加入100 μL菌悬液，再向孔中加入100 μL丁香油母液进行等倍稀释，混合均匀后反复吹打，此时丁香油的终浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL。随后将样品放置在37 ℃培养箱中培养24 h，观察金黄色葡萄球菌生长情况，用接种环蘸取96孔板中溶液在TSA平板上划线，置于37 ℃培养箱中培养24 h，观察平板上细菌生长情况。依此方法测定薄荷油、百里香油及月桂酸对金黄色葡萄球菌的MIC。实验以不含抑菌物的TSB菌悬液为阴性对照，不含细菌的TSB为阳性对照，并另外做乙醇空白试验，每组样品做三个平行。MIC定义为在肉眼观察下，抑菌物抑制金黄色葡萄球菌生长的最低浓度。

1.3.4 分级抑菌浓度（FIC）的测定

参照Bag等[15]的方法，采用棋盘滴定法测定三种植物精油和月桂酸联合使用时对金黄色葡萄球菌的分级抑菌浓度（Fractional Inhibitory Concentration，FIC）。按照1.3.1所述制备菌悬液，1.3.2的方法配置三种精油及月桂酸母液。由1.3.3所得结果，用无菌TSB稀释抑菌物母液，得到浓度为8×MIC、4×MIC、2×MIC、1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC的溶液。在96孔板中每孔加入100 μL菌液，50 μL不同浓度的精油和月桂酸溶液分别加入到96孔板的横行竖列中，以得到最终浓度（2×MIC、1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC）。反复吹打混合均匀后放置在37 ℃培养箱中培养24 h，观察96孔板中金黄色葡萄球菌的生长情况，每组样品三个平行。记录并计算每个样品的 FIC值，按照如下公式计算每组样品的分级抑菌浓度系数（Fractional Inhibitory Concentration Indices，FICI）。

FICI计算公式：

FICI解释标准：协同作用（FICI≤0.5）；相加作用（0.5＜FICI≤1）；无关（1＜FICI≤4）；拮抗作用（FICI＞4）。

1.3.5 丁香油、月桂酸及其协同组合对金黄色葡萄球菌生长的影响

根据1.3.4的实验结果，选择具有协同作用的组合丁香油和月桂酸进行后续实验。参照 Basri和KhaIron[16]的方法，测定丁香油和月桂酸在不同浓度下（1/2×MIC丁香油、1/2×MIC月桂酸、1/4×MIC丁香油+1/4×MIC月桂酸和1/2×MIC丁香油+1/2×MIC月桂酸）单独或联合使用对金黄色葡萄球菌生长的影响。按照1.3.1所述的方法制备105CFU/mL菌悬液，1.3.2的方法配置三种精油及月桂酸母液，在灭菌试管中加入菌悬液及不同浓度丁香油和月桂酸溶液，得到最终浓度（1/2×MIC丁香油、1/2×MIC月桂酸、1/4×MIC丁香油+1/4×MIC月桂酸和1/2×MIC丁香油+1/2×MIC月桂酸）。将试管放置于37 ℃培养箱中培养，分别在0、0.5、1、1.5、2、3、4、8、12、24 h 后从试管中吸取50 μL样液，用0.85%无菌生理盐水稀释后，选取适宜稀释度，取样100 μL注入TSA平板上涂布，37 ℃培养箱中培养，24 h后计算菌落数。每个样品三个平行。

1.3.6 丁香油、月桂酸及其协同组合对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响

当细菌细胞膜的完整性被破坏时，细胞大分子内容物（如核酸和蛋白质）被释放到培养基中[17]。与1.3.5相同，制备经不同浓度丁香油和月桂酸处理的样品，对照组不添加抑菌物。样品置于 37 ℃恒温培养箱培养，在培养0、1、2、4、8、24 h后，取样，8000 r/min离心 5 min，收集上清液，用多功能酶标仪分别测定上清液在260 nm和280 nm处的吸光值，以评估核酸和蛋白质的泄漏情况。每组样品做三个平行。

按照1.3.1的方法制备菌悬液，8000 r/min离心5 min收集菌体，用5%葡萄糖溶液重悬，反复洗涤，至菌液的电导率与 5%葡萄糖溶液的电导率相当，此菌液作为等渗液。按照1.3.2的方法配置丁香油和月桂酸母液，与1.3.5相同，制备经不同浓度丁香油和月桂酸处理的样品，对照组不添加抑菌物，其中菌悬液使用等渗液替代。样品置于37 ℃恒温培养箱培养24 h，分别于0、1、2、3、4、5、6、10、24 h测定样品电导率，记为 L2。5%葡萄糖与不同浓度的丁香油和月桂酸混合，其电导率记为L1。等渗液沸水浴5 min，冷却后测定电导率，记为L0。每组样品做三个平行。金黄色葡萄球菌经不同浓度丁香油和月桂酸及其组合处理后，相对电导率（Relative Electric Conductivity，REC）由下列公式计算：

1.3.7 生鲜米粉保鲜效果评价

生鲜米粉（共10批次）从当地一家生鲜超市购买，并在2 h内运抵实验室进行下一步实验。根据感官可接受性和食品基质对保鲜效果的影响，制备浓度为丁香油2 μg/mL、月桂酸9 μg/mL的抑菌保鲜液。将生鲜米粉随机分为两组：1-对照组（记为CK），浸泡在蒸馏水中；2-处理组（记为 T），浸泡在丁香油（2 μg/mL）和月桂酸（9 μg/mL）抑菌保鲜液中。每组样品在相应的处理溶液中浸泡1 min后，捞出沥干并包装在聚乙烯袋中，在4 ℃保存并进行菌落总数、酸度值测定及感官分析实验。

将生鲜米粉在95 ℃的水浴中杀菌40 min[18]，捞出沥干，将金黄色葡萄球菌菌悬液接种到生鲜米粉中，使得生鲜米粉中初始金黄色葡萄球菌菌落数达到 5～7 lg CFU/g。将生鲜米粉随机分为两组：1-对照组（记为CK），浸泡在蒸馏水中；2-处理组（记为T），浸泡在丁香油（2 μg/mL）和月桂酸（9 μg/mL）抑菌保鲜液中。每组样品在相应的处理溶液中浸泡1 min后，捞出沥干并包装在聚乙烯袋中，在4 ℃保存并进行金黄色葡萄球菌菌落数测定。

为了确定抑菌保鲜液的保鲜效果，按照 GB 4789.2-2016《食品微生物学检验菌落总数测定》的方法并略作修改，测定生鲜米粉中的菌落总数（TPC）。将25 g生鲜米粉用225 mL 0.85%无菌生理盐水均质后，用0.85%无菌生理盐水配制成10倍系列稀释液，选取适宜稀释度进行平板计数。每组样品做三个平行。

酸度值的测定参照 GB 5009.239-2016《食品酸度的测定》第一法并有改动，每组（15 g）样品用150 mL蒸馏水研磨成匀浆，均质，在匀浆中滴入 5滴三氯甲烷进行浸提。浸提完成后，匀浆以5000 r/min离心5 min，收集上清液，测定酸度值。每组样品做三个平行。

4 ℃冷藏72 h后，对各组样品进行感官分析。生鲜米粉在沸水中漂烫3 min。热烫后，由10名训练有素的专家对米粉的颜色、外观、气味、口感和质地进行1到10的可接受性评分，其中10=非常喜欢，1=非常不喜欢。评分低于5分意味着没有通过可接受性感官测试。

1.4 数据处理

使用SPSS Statistics 23软件对数据进行差异性显著分析，p＜0.05为显著差异，用Origin 2018进行数据绘图。

表1 生鲜米粉感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standard of fresh rice noodles

2 结果与讨论

2.1 最小抑菌浓度和分级抑菌浓度

如表2所示，丁香油对金黄色葡萄球菌的MIC低于薄荷油和百里香油。三种精油对金黄色葡萄球菌的MIC为 2.0～7.5 μg/mL。月桂酸对金黄色葡萄球菌的MIC为9.0 μg/mL。结果表明，三种精油和月桂酸对金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用。

表2 植物精油与月桂酸联合作用时对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度和分级抑菌浓度系数Table 2 The MICs and FICI values of combination of the essential oils and lauric acid against S.aureus

不同的抑菌物联合使用时可能会产生协同效应。三种植物精油与月桂酸联合作用对金黄色葡萄球菌的抑菌效果如表2所示，其中丁香油-月桂酸的FICI为0.50，表现为协同作用，薄荷油-月桂酸和百里香油-月桂酸表现为相加作用。Kim等[9]的研究指出，百里香酚-月桂酸联合处理对大肠杆菌 O157:H7表现出协同杀菌作用，0.50+1.00 mmol/L和1.00+1.00 mmol/L的处理使细菌数量由 7.54 lg CFU/mL降至 0.43 lg CFU/mL或无法检测。百里香酚是百里香油的主要成分，二者作用效果存在差异，且金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7的细胞结构不同。Gomori等[19]证实百里香油中百里香酚比例的下降，导致精油的抗菌和抗生物膜形成能力的变化，并且与微生物的类型也有关系。本研究揭示了丁香油和月桂酸对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）的协同抑制作用。

2.2 丁香油、月桂酸及其协同组合对金黄色葡萄球菌生长的影响

生长曲线结果如图1所示。从时间-杀菌动力学曲线上可以观察到，丁香油、月桂酸联合处理时，金黄色葡萄球菌的数量比单独使用丁香油、月桂酸时有所减少。对照组24 h后细菌数量增加至9 lg CFU/mL左右。丁香油或月桂酸单独处理时，对金黄色葡萄球菌的抑制作用有限，当两种抑菌物联合处理时，对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用。低浓度联合处理（1/4 MIC+1/4 MIC）作用8 h后，细菌数量下降2～3 lg CFU/mL，然后逐渐增加，24 h恢复到初始浓度。高浓度联合处理（1/2 MIC+1/2 MIC），2 h内细菌数量降至检测不到。结果证实了丁香油、月桂酸组合对金黄色葡萄球菌的协同抗菌效果。我们的结果与 Purkait等[5]的研究一致，两种物质联合抑菌效果优于单一成分抑菌效果。

2.3 细胞膜通透性的影响

260 nm和280 nm处的吸光度被广泛用作核酸和蛋白质从细胞内渗漏到细胞外的标志[20，21]。如表3所示，丁香油和月桂酸单独处理金黄色葡萄球菌时，260 nm和280 nm处的吸光度与对照组无显著差异。经1/2 MIC+1/2 MIC处理的金黄色葡萄球菌的核酸和蛋白质释放量较对照组显著增加，260 nm、280 nm处的吸光值分别由1.64、1.71升高至1.81、2.28，表明核酸和蛋白质的漏出量是各处理中最高的。Cui等[20]的研究表明，丁香油处理后细菌结构遭到破坏，导致细胞膜通透性改变，核酸泄漏，260 nm吸光度增加。当不同浓度的月桂酸处理细胞时，与阴性对照相比，核酸泄漏的量也明显增加，260 nm处吸光度的增加证明了这一点[22]。同样，丁香油和封装大气压等离子体联合使用对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的280 nm处吸光度比对照组或两种物质单独处理组的吸光度高[23]。因此，丁香油和月桂酸联合使用，二者协同损伤细胞膜，增加细胞膜的通透性，从而导致更多的核酸和蛋白质泄漏。

表3 金黄色葡萄球菌大分子内容物渗漏Table 3 Leakage of macromolecule content of S.aureus

细胞膜是细菌转运各种离子和无机盐的通道，当细胞膜受损渗透性改变时，电解质溢出胞外，因此可以通过测量培养液电导率的变化来反映细胞膜的损伤程度[24]。丁香油和月桂酸联合处理金黄色葡萄球菌时，电导率的变化如图2所示。经丁香油、月桂酸混合溶液处理后，随着时间的延长，培养液电导率逐渐增加。随着丁香油和月桂酸浓度的增加，电导率也增加。与对照组相比，经低、高浓度丁香油、月桂酸协同处理组电导率由2.50%升高至12.20%、29.50%。同样，丁香油、月桂酸单独使用时，对金黄色葡萄球菌的细胞膜的影响有限。对照组培养液中电导率的微小变化可能与细胞的正常溶解和死亡有关[17]。一些研究表明，丁香油和月桂酸显著影响细胞膜，引起细胞溶解，导致细胞完整性丧失和细胞膜通透性增加，这与我们的研究结果一致[20，25]。细胞膜是细胞内物质（如核酸、蛋白质和多种离子）通过的屏障，这些物质是促进细胞膜功能所必需的[26]。因此，细胞膜损伤引起的核酸、蛋白质和多种离子的外泄可造成细菌的死亡[27]。

2.4 生鲜米粉保鲜效果评价

菌落总数是衡量食品是否安全卫生的重要指标，我国现有的食品标准基本上均对菌落总数有明确要求。各组生鲜米粉的菌落总数变化如图3所示。从结果可以看出，在贮藏72 h期间，对照组生鲜米粉的菌落总数在 24 h内超过了规定的安全限值（5.48 lg CFU/g）[12]，与对照组相比，处理组生鲜米粉的细菌数量缓慢增加，菌落总数超过规定限值的时间为72 h，表明抑菌保鲜液对生鲜米粉中微生物的生长有抑制作用。从初始细菌数量看，处理组生鲜米粉的初始菌落数比对照组的低至少1.5 lg CFU/g，表明抑菌保鲜液浸泡可以显著降低生鲜米粉的初始细菌量，对生鲜米粉中的微生物有良好的抑制及杀灭作用。Dunn等[28]的研究表明，丁香油或百里香油乳剂可有效减少辣椒上沙门氏菌的交叉污染，多数情况下沙门氏菌数量低于检测限（1 CFU/10 g；p＜0.05），可作为采后农产品清洗系统中氯的合适替代品。同样，Tangwatcharin和Khopaibool[29]发现将月桂酸、月桂酸单甘油酯以及乳酸联合使用时，可显著抑制鲜猪里脊中金黄色葡萄球菌以及菌落总数的生长。

图4为在4 ℃下，72 h贮藏时间内生鲜米粉中金黄色葡萄球菌的生长变化情况。对照组中金黄色葡萄球菌菌落数呈现先减少后增加趋势，这可能是金黄色葡萄球菌在适应新环境时产生的滞后现象[30]。在贮藏终点，对照组金黄色葡萄球菌菌落数增加至 7.96 lg CFU/g。在72 h贮藏期内，处理组金黄色葡萄球菌菌落数低于对照组，贮藏期间处理组菌落数降低了1.65 lg CFU/g。此外，与对照组相比，处理组的金黄色葡萄球菌初始菌落数降低了0.92 lg CFU/g。由Oliveira等人[31]的研究可知，丁香油对金黄色葡萄球菌有较好的抑制效果，且与浓度成比例。Kelsey等[32]的研究表明，月桂酸能有效抑制金黄色葡萄球菌的生长。

酸度是评价生鲜米粉品质的主要指标之一，食品中酸度值的增加会对感官质量产生不利影响。图5a展示了生鲜米粉在储藏过程中酸度值的变化。在储藏的前24 h内，各组生鲜米粉的酸度均保持相对稳定。24 h后，对照组的酸度值至少增加0.8 °T，而处理组生鲜米粉的酸度值变化不大。值得注意的是，随着储藏时间的不断延长，生鲜米粉的酸度值与细菌数量呈正相关，表明微生物是生鲜米粉腐败变质的主要决定因素。在富含碳水化合物的食品中，由于微生物的活动，食品中的酸度变化是常见的，它们消耗碳水化合物并利用新陈代谢来产酸和降低pH[12]。Li等[33]研究发现新鲜面条在储藏过程中pH值持续下降，pH值与菌落总数呈极显著正相关（p＜0.01）。此外，Angiolillo等[34]的研究表明，不加任何添加剂的意大利面因微生物腐败，会出现pH下降和大肠菌群增加。这些结果表明，抑菌保鲜液处理可以通过抑制细菌的生长来控制酸度值的增加。

感官特性是食品变质的最直接反映，随着储存时间的增加，食品的颜色、外观、气味、口感和质地逐渐发生不可接受的变化。每组生鲜米粉的感官得分如图5b所示，对照组生鲜米粉的气味平均得分最低，处理组生鲜米粉的颜色平均得分最高。另外，各组生鲜米粉样品在储藏过程中质地和外观的平均得分变化不大。所有特征的平均得分都在可接受阈值以上。结果表明，72 h后，处理组生鲜米粉的感官品质和可接受性均高于对照组。在碳水化合物和蛋白质含量较高的食品中，由于微生物作用造成食品品质劣变是较为常见现象，其中包括微生物大量增殖、发酵产酸、pH值下降等。因此本文分析，经过抑菌保鲜液处理的生鲜米粉，是通过抑制其中微生物的生长，进而保持了生鲜米粉的品质。

综合菌落总数、金黄色葡萄球菌菌落数、酸度值、感官评分等评价指标，在4 ℃下贮藏72 h，丁香油和月桂酸抑菌保鲜液处理对生鲜米粉有较好的保鲜效果，对其中金黄色葡萄球菌的生长具有良好的抑制作用。