不同生长期粉葛不同部位中黄酮类成分动态积累分析与评价

★ 曾慧婷 张媛媛 陈超 黄琦 何小群 张建华 王小青 李晶 虞金宝（. 江西省中医药研究院 南昌 330046；. 江西绿色生态葛研究所 江西 上饶 334000）

粉葛为豆科植物甘葛藤（Pueraria thomsoniiBenth.）的干燥根，与临床常用药材葛根（Pueraria lobate＜Willd.＞ Ohwi），均具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络、解酒毒等功效［1］，富含系列黄酮类化合物，如葛根素、大豆苷、染料木苷、染料木素、大豆苷元等。现代药理学研究表明，该黄酮类成分在心血管系统、降血糖、抗癌、抗酒精中毒、保护脑神经细胞等方面表现出显著药理活性［2-6］。粉葛作为提取食用葛粉的主要来源，其淀粉含量高达40%，故素有“北参南葛”“亚洲人参”之称。葛根（野葛）多为野生，分布极广，除新疆、西藏和青海等少数省份外，全国各省区均有分布，粉葛则多为栽培种，在广东、广西、江西、云南、四川、重庆等地均有人工栽培［7］。关于葛的产区为历代本草所记载，《本草经集注》曰：“南康、庐陵间最胜，多肉而少筋，甘美；但为药用之，不及此间耳”，《图经本草》曰：“今处处有之，江浙尤多”，均指出江西已是葛根的主产区之一，且葛根味道甜，适合食用［8］。

随着粉葛在医药及食品领域需求量的不断增加，加之国家中药大健康产业相关政策的引导，粉葛种植得到大面积推广。除用于提取淀粉、制作葛粉系列保健食品，目前对于粉葛的研究尚主要集中于其根部，葛根采收加工时其地上部分茎叶、芦头、葛根渣等废弃物往往未得到有效利用，为环境带来严重的负担，文献报道及前期研究发现，该类废弃物中尚含有丰富的黄酮类、多糖类、蛋白质类等资源性化学成分［9-10］。本文以江西省粉葛新培育品种“赣葛2号”为研究对象，对不同生长期粉葛根、茎和叶中4种主要黄酮类成分（葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元）进行分析评价，以期为粉葛地上部分茎和叶的采收和资源化利用提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器

HP-1260全自动高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；CQ-250超声波清洗器（上海船舶电子设备研究所）；AG-135电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；高速中药粉碎机YF-1000（浙江瑞安市永历制药机械有限公司）。

1.2 材料

葛根素（批号：1110752-201615）、大豆苷元（批号：111502-200402）、大豆苷（批号：111738-201603）等对照品购于中国食品药品检定研究院，染料木苷（批号：B21038）购于上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98%。甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

粉葛样品于2018年5月—2018年12月采自江西绿色生态葛研究所“赣葛2号”种植基地，经江西省中医药研究院虞金宝研究员鉴定为粉葛（P. thomsoniiBenth.）的栽培品种（一年生），样品（根、茎和叶）采集后于50℃烘干，经粉碎成粗粉（40目），常温密封干燥保存，供分析用。取样时间、生长阶段、物候期及对应的采收部位划分见表1。

表1 取样时间、生长时期及采收部位

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流动相为0.1%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～2 min，85% A；2～10 min，85%～80% A；10～14 min，80%～70% A；14～20 min，70%～68% A；20～28 min，68%～40% A；28～30 min，40%～85% A；30～31 min，85% A。柱温35 ℃恒温，流速1.0 mL/min，检测波长250 nm，进样量10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元对照品适量，用80%甲醇配成质量浓度分别为0.294、0.162、0.183、0.260 mg/mL的混合对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密取不同生长期粉葛根、茎和叶样品粉末1.00 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 60%乙醇，称重，90 ℃回流1 h，补足失重，趁热滤过，合并滤液，0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察取混合对照品贮备液，分别稀释成系列质量浓度的对照品溶液，按“2.1”项下分别进样，记录峰面积，以对照品进样浓度（μg/mL）为横坐标X，峰面积为纵坐标Y绘制标准曲线，得到4个黄酮类成分的回归方程及线性范围，检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别在信号对噪音比值为3和10时测定。所测定的4个化学成分线性关系良好，且灵敏可靠。见表2。

表2 线性回归方程和相关系数

2.4.2 精密度试验取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，得到葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元峰面积的RSD分别为0.24%、0.14%、0.09%、0.11%。

2.4.3 稳定性试验取8月份采葛茎1号样品的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定峰面积，得到葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元峰面积的RSD分别为2.13%、3.70%、1.62%、2.45%，表明供试品溶液稳定性良好。

2.4.4 重现性试验取8月份采葛茎1号样品6份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录各峰面积，葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元峰面积的RSD分别为2.31%、1.28%、2.01%、1.92%。表明重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验精密称取6份已知含量的8月份采葛茎1号样品粉末各1 g，分别加入适量对照品混合液，按“2.3”项下制备供试品溶液，依次测定，计算各对照品的平均回收率，得到葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元的平均回收率分别为101.10%、99.25%、98.64%、100.89%，测定其RSD分别为1.39%、2.51%、1.96%、2.03%。

2.5 样品测定

所有样品按“2.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，并计算各化合物含量，混合对照品及粉葛不同部位样品HPLC色谱图如图1所示，不同采收期粉葛不同部位中黄酮类成分含量动态积累变化见表3、图2。

图1 混合对照品及粉葛不同部位样品HPLC色谱图

结果显示，粉葛的根与茎中黄酮类成分相似，主要为葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元，葛叶中除葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元外，尚有含量较高的成分待鉴定。以所测定的葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元的含量之和计算总黄酮含量，总黄酮含量在粉葛不同部位中的分布为根＞茎＞叶。

3 讨论

3.1 粉葛不同部位中黄酮类化学成分的分布特征

表3结果显示，通过HPLC法检测粉葛中4种黄酮类成分（葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元）含量，发现葛根素在根中含量最高，可达3.06%，其次为茎，最高可达0.78%，在叶中含量最低。大豆苷在粉葛不同部位中的分布规律同葛根素，为根＞茎＞叶，染料木苷的含量分布特征为茎＞叶＞根，大豆苷元在根中的含量高于茎，在叶中未检测到，表明粉葛地上部分与地下部分中皆含有黄酮类成分。根据HPLC色谱图（图1）可知，粉葛根与葛藤茎中化学成分组成相似，葛叶中除含有与根、茎相同的黄酮类成分，尚有多种含量可观的成分有待确定，且笔者前期研究发现葛花中黄酮类成分完全不同于粉葛根、茎、叶，主要为鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷、染料木苷、鸢尾苷、葛花苷、6″-O-木糖基黄豆黄苷，在葛根果实中未检测到相关化学成分，这一研究结果与文献报道相一致［9，11］。

表3 不同采收期粉葛不同部位中黄酮类成分含量测定 mg/g

3.2 不同生长期粉葛不同部位中黄酮类成分动态积累规律

植物体是一个整体，各组织、器官和系统间存在一定生长相关性，彼此独立分工又紧密联系，植物环境因子如水分、温度、光照等对植物生长和有效成分积累存在巨大影响。不同生长期粉葛根、茎和叶中黄酮类成分含量动态积累变化如图2所示，在整个生长期内，粉葛根中黄酮类成分含量随时间呈逐渐递增趋势，在10月底地上部分枯萎，进入根部速生期时达到最高，之后稍有所回落，最高为3.51%。葛茎中有效成分的积累分别在7月快速生长期和12月休眠期达到峰值，可达1.31%。葛叶中黄酮类成分积累在10月底地上部分枯萎时达到最高。考虑粉葛为多年生植物，黄酮类成分含量可能因生长年限增加而积累。总体来看，粉葛根中有效成分黄酮类含量在秋、冬季为最高，同《中国药典》所记载“秋、冬二季采挖”一致。茎是根和叶之间起输导和支持作用的植物体重要营养器官，葛茎中有效成分含量在7月和12月最高，而叶中黄酮类成分在10月积累量最大，综上所述得出，粉葛地上部分资源性化学成分种类丰富且含量可观，可作为获取黄酮类资源性化学成分的新来源加以利用，在秋冬季粉葛采收时，即其地上部分茎叶的适宜采收期。

图2 不同生长期粉葛不同部位中黄酮类成分含量动态积累变化

3.3 粉葛地上部位资源性价值分析与资源利用探讨

葛根和粉葛均被历版药典所收载，且同为药食同源品种，葛根（野葛）为临床常用中药材，主要活性成分为黄酮类化合物，其传统用药部位为地下根，粉葛功能主治同葛根，作为提取葛粉的主要来源。本实验研究对象为粉葛培育品种“赣葛2号”，通过研究粉葛不同部位不同生长期黄酮类成分分布及动态积累规律，揭示粉葛地上部分中富含黄酮类成分，尤其是葛茎含有同根部相同的化学成分，葛根素含量可达2.86%，超过药典规定葛根（野葛）中葛根素≥2.40%的含量测定标准，葛茎、叶中黄酮类成分经提取富集可用于制备天然抗氧化剂、治疗或改善心血管疾病的医药中间体和医药保健产品。此外，葛茎和叶中富含蛋白质、多糖、微量元素等资源性化学成分，具有广泛应用前景，可用于保健食品、膳食补充剂和动物青贮饲料的开发［12］。

众所周知，在中药材种植生产过程中，适宜采收期对于药材的产量和质量至关重要。本研究通过采收不同生长期粉葛不同部位，对其黄酮类成分进行定性定量分析，在明确粉葛根、茎和叶中主要化学成分的同时，对其生长过程中黄酮类成分的动态积累进行了分析评价，若以黄酮类成分积累量为评价指标，在秋冬季粉葛采挖时其地上茎叶可采收加以利用，若以粉葛地上部分茎叶中蛋白质、多糖等初生代谢产物为评价指标，其最佳采收期的确定还需进一步研究。本文基于前期研究，为粉葛茎、叶资源价值的发现及其综合利用提供科学依据，要全面认识粉葛茎、叶，以达到资源的最大化利用，还需大量深入细致的系统性研究。