膀胱癌患者血清miR-21、miR-119a表达量与肿瘤恶性增殖及侵袭的相关性分析

吴德柱，李清林，彭 娜，林建峰

膀胱癌是泌尿系统最为常见的肿瘤疾病，近年来膀胱癌发病率及病死率较高，且呈逐渐增长的趋势[1]，严重危害患者的生命健康。有研究显示[2]，膀胱癌的发病率会随年龄增长而上升，且男性发病率高于女性。目前，多种疗法对膀胱癌具有显著的临床效果[3-4]，保障了患者生命健康，但膀胱癌细胞具有很高的增殖能力和侵袭能力，临床诊治中并不能完全根治所有患者，有些患者甚至在术后有复发的可能性。因此开展膀胱癌相关分子机制研究以寻求有效诊断及评估肿瘤恶性特征的生物标志物对膀胱癌的早期检测、早期治疗及预后具有重要的意义。微小核糖核酸（MicroRNAs,miRNAs）是一类进化上保守的非编码小分子RNA，具有在翻译水平调控基因表达的功能，研究显示多种miRNAs 与肿瘤抑制或致癌功能具有密切联系[5]，而膀胱癌患者中可见血清miR-21和miR-119a异常表达。许多学者研究发现，miRNA 的表达量与癌症患者的性别、年龄之间并无明显的相关性[6-7]。因此本研究旨在观察血清miR-21和miR-119a是否可以预测膀胱肿瘤并分析其与肿瘤恶性增殖及侵袭的关系，以期为临床膀胱癌的早期诊断与治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 一般资料 膀胱癌患者及健康体检者各48例，分为膀胱癌组和正常对照组。膀胱癌组平均年龄（59.54±10.17）岁，男女比例为22/26；正常对照组平均年龄（59.27±8.71）岁，男女比例为22/26，两组年龄、性别等临床资料分布具有可比性，差异无统计意义（P>0.05）。纳入标准：①膀胱癌符合膀胱癌诊断标准[8]；②所有受试者知情研究内容，表示愿意配合研究工作并签署知情同意书。排除标准：①合并其他肿瘤疾病患者；②合并其他泌尿系统疾病患者；③近期内行放疗、化疗等治疗措施者；④急危重症疾病化患者；⑤精神疾病者，妊娠期者。本研究经医院伦理委员会审核批准（伦理号：YXLL20170201），符合伦理道德要求。

1.2 实验材料 试剂miR-21，miR-119a 检测试剂盒、TMM 试剂盒购于北京奥维亚生物技术有限公司；蛋白裂解液及二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒购自上海碧云天公司，第10 号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白（tension of the protein，PTEN）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、细胞周期蛋白D1（cell cycle egg D1，CyclinD1）、转化生长因子-β（transforming growth factor -β，TGF-β）、β-连环蛋白（Beta-catenin，β-catenin）、N-钙黏蛋白（Ncadherin）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）一抗均购自美国Abcam 公司，β-catin 一抗购于北京索莱宝公司，MBR-506D 冰箱购自日本三洋有限公司，PCR 仪购自美国默赛飞公司。

1.3 方法

1.3.1 荧光定量PCR 检测miR-21、miR-119a 表达量 抽取所有受试者清晨静脉血5 mL，离心后收集上清液，用Trizol 试剂提取和收集总RNA，采用荧光定量PCR 检测血清miR-21、miR-119a 表达量。取行膀胱癌根治术的膀胱癌患者膀胱组织和癌旁正常组织（距癌组织5 cm 处）放入研磨器中，加入液氮粉碎并研磨，利用组织裂解液裂解组织，用Trizol 试剂提取和收集总RNA，采用荧光定量PCR检测组织miR-21、miR-119a表达量。荧光定量PCR操作方法如下：对目标RNA 逆转录后，设置PCR 反应条件:95 ℃预变性30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，重复40 个循环实施扩增反应，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s 制备溶解曲线，以β-actin 作为内部参考，采用2-ΔΔCt方法计算miR-21、miR-119a 的相对表达量。相关引物见表1。

表1 引物名称及相关序列

1.3.2 蛋白质印迹法（Western Blot，WB）检测相关蛋白表达量 取行膀胱癌根治术的膀胱癌患者膀胱组织和癌旁正常组织（距癌组织5 cm 处）放入研磨器中，加入液氮粉碎并研磨，利用组织裂解液裂解组织，提取组织液总蛋白，采用BCA 法行蛋白定量。在120 V 电压条件下持续电泳至样品到达凝胶底部，半干转膜仪转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，洗膜后剪下相应条带，分别加入GAPDH、PTEN、PI3K、AKT、CyclinD1、TGF-β、β-catenin、Ncadherin、E-cadherin 一抗，在4 ℃下孵育过夜。次日取出PVDF 膜，用洗膜缓冲液（TBST）洗脱3 次，再加入二抗反应液，置于摇床上摇动，洗脱3 次。使用ECL溶液显色，自动电泳凝胶成像分析仪采集图像，以目的蛋白与GAPDH 的吸光度比值表示相对蛋白表达量。

1.3.3 提取细胞 取受试者新鲜组织标本，剪碎，用1%的胰酶消化，孵育30 min后加入血清终止反应。用移液管反复吹打，用70 μm 孔径的细胞筛过滤，除掉大块没消化的团块。得到的滤过液离心后，沉淀物培养。然后采用分选型流式细胞仪提取细胞。

1.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡能力 收集细胞，采用PBS 洗涤，用蛋白酶消化液悬浮细胞，300 r/min离心10 min后在室温下加入5 μL的PI染色液，5 min后PBS洗涤，流式仪检测细胞凋亡率。

1.3.5 流式细胞术检测细胞周期 收集细胞，PBS缓冲液冲洗后分别加入胰蛋白酶消化5 min，离心后加入冰预冷的70%的乙醇固定(4 ℃) 过夜(破膜)。每瓶加入500 μL PI染液后，于低温(4 ℃)孵育箱中孵育30 min，然后进行检测。结果用细胞周期拟和软件分析凋亡细胞所占百分率。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（）表示。两组均值比较采用两独立样本t检验，双变量相关采用Pearson 相关分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者血清miR-21 和miR-119a 表达水平 膀胱癌组血清miR-21 和miR-119a 相对表达量均高于正常对照组（均P<0.05）。图1。

图1 受试者血清miR-21和miR-119a相对表达量比较

2.2 ROC 曲线分析血清miR-21 和miR-119a 预测膀胱癌诊断价值 血清miR-21 和miR-119a 相对表达量以约登指数最大的cut-off为临界点，确定最佳临界值分别为1.08和1.15时，相对应的曲线下面积为0.995（0.986 - 1.000，P<0.05）和0.996（0.990 -1.000，P<0.05），血清miR-21 和miR-119a 预测膀胱癌具有良好的诊断价值。图2。

图2 ROC曲线分析血清miR-21和miR-119a预测膀胱癌结果

2.3 膀胱癌组织和癌旁正常组织miR-21 和miR-119a 表达水平 与癌旁正常组织比较，膀胱癌组织miR-21和miR-119a相对表达量均升高（均P<0.05），图3。

图3 膀胱癌组织和正常组织miR-21和miR-119相对表达量比较

2.4 膀胱癌组织和癌旁正常组织相关增殖基因表达水平 与癌旁正常组织比较，膀胱癌组织PTEN相对表达量降低（均P<0.05），PI3K、AKT、CyclinD1相对表达量均升高（均P<0.05）。图4。

图4 膀胱癌组织和正常组织相关增殖基因表达水平比较

2.5 膀胱癌组织和正常组织相关侵袭基因表达水平 与癌旁正常组织比较，膀胱癌组织E-cadherin相对表达量降低（均P<0.05），TGF-β、β-catenin、Ncadherin相对表达量均升高（均P<0.05）。图6、图7。

图5 膀胱癌组织和正常组织相关侵袭基因表达水平比较

2.6 细胞凋亡率 与膀胱癌正常组织比较，膀胱癌组织凋亡率较低，P<0.05。图6。

图6 膀胱癌组织和正常组织凋亡率比较

2.7 细胞周期 与膀胱癌正常组织比较,膀胱癌组织G1期的比例低于膀胱癌正常组织，S、G2期的比例则高于膀胱癌正常组织，P<0.05。图7。

图7 膀胱癌组织和正常组织周期分布比较

2.8 血清miR-21和miR-119a与癌组织增殖基因及侵袭基因相关性分析 Pearson相关分析显示，血清miR-21 和miR-119a 表达水平与PI3K、AKT、Cy‐clinD1、TGF-β、β-catenin 及N-cadherin 表达呈正相关（均P<0.05），与PTEN 和E-cadherin 表达呈负相关（均P<0.05），表2。

表2 Pearson相关性分析统计值

3 讨论

膀胱癌早期临床症状并不明显，确诊时癌症已经发展为中晚期，无疑增加临床治疗难度，而且治疗中晚期膀胱癌往往整体预后情况较差。此外，膀胱癌的恶性程度决定了患者预后效果，但目前临床常用的评估癌症恶性程度的方法是通过穿刺活检或手术取癌组织进行检测，此种方法不能多次获取，且不利于疾病病情的动态评估，而血清学指标避免了以上局限性，因此开展膀胱癌相关分子机制研究以寻求有效诊断及评估肿瘤恶性特征的血清学标志物对膀胱癌的早期检测、早期治疗及预后具有重要的意义。

miR-21 位于位于染色体17 (17q.23.1)上，其有高度保守的启动子，并且通过调控多种靶基因而参与多种肿瘤疾病的发生。研究发现miR-21 靶向作用于TET1 促进结直肠癌细胞增殖、侵袭及迁移[9]；miR-21 调控程序性细胞死亡4 基因的表达而抑制宫颈癌细胞增殖和侵袭能力[10]；miR-21 调控人唾液富组蛋白1可抑制肺癌细胞迁移和侵袭[11]。基于以上研究发现，miR-21通过靶向作用多种蛋白而影响肿瘤增殖、迁移、侵袭等作用。本研究发现，膀胱癌患者血清miR-21 表达水平明显高于正常人，膀胱癌组织miR-21 表达水平明显高于癌旁组织，提示miR-21过表达与膀胱癌的发生发展密切相关，多项研究表明miR-21 表达与膀胱癌进展和预后相关[12-14]。miR-119a 是一种存在于第19 号位染色体上的核糖核酸，研究显示miR-119a 在膀胱癌组织中表达量显著上升，上调miR-119a 可能与靶向抑制脆性组胺三联体蛋白的表达来促进膀胱肿瘤细胞增殖与迁移效应有关[15]。与上述研究结果一致，本研究膀胱癌组织miR-119a 表达水平高于癌旁正常组织，而且膀胱癌患者血清miR-119a 表达水平明显高于正常人，提示miR-119a 参与膀胱癌生物学作用。通过分析膀胱癌组织miRNAs 表达量与血清表达量的关系，发现膀胱癌患者血清miR-21和miR-119a 表达水平与其癌组织miR-21 和miR-119a 表达水平表达趋势一致，两者呈正向相关，结果表明了检测膀胱癌患者血清miR-21 和miR-119a表达水平可间接反映出癌组织miR-21 和miR-119a表达水平。鉴于膀胱癌患者与正常人miR-21 和miR-119a 表达量差异较大，本研究进一步进行ROC 曲线分析，评估血清miR-21 和miR-119a 预测膀胱癌诊断价值，ROC曲线分析结果显示，两者曲线下面积均大于0.8，说明血清miR-21 和miR-119a 预测膀胱癌具有较高的诊断价值，提示血清miR-21、miR-119a可能是膀胱癌的潜在生物标志物。

目前未有研究明确指出血清miR-21 和miR-119a 与膀胱癌增殖、侵袭等恶性特征有直接联系，因此本研究对血清miR-21和miR-119a表达量与膀胱癌增殖、侵袭的关系进行探索。已有研究显示，PTEN、PI3K、AKT 和CyclinD1 蛋白可用于细胞增殖评估，TGF-β、β-catenin、N-cadherin 和E-cadherin 蛋白可用于细胞发生侵袭评估[16]。PTEN 普遍被认为是抑癌基因，在抑制多种恶性肿瘤发生中扮演着重要的角色，PTEN 能够抑制PI3K/AKT 信号通路活化，致使PI3K和AKT蛋白发生去磷酸化，导致信号转导活性降低无法启动下游cyclinD1 等基因的表达[17-18]，进而影响膀胱癌细胞增殖作用[19]。本研究结果显示，膀胱癌组织PI3K、AKT 和CyclinD1 蛋白表达量较癌旁正常组升高，而PTEN 蛋白表达量降低，以上结果在其他研究中得以证实[20-21]。实验结果表明PTEN蛋白表达降低，PI3K、AKT和CyclinD1蛋白表达升高可促进癌细胞增殖。癌细胞发生上皮间质转化的过程中，TGF-β1是重要的诱导因子，通过细胞内β-catenin 进行信号转导能够增加间质标志基因N-cadherin、增强细胞的运动性能[22-23]，癌细胞侵袭作用与上述分子表达高度相关，在研究结果中，膀胱癌组织TGF-β、β-catenin和N-cadherin蛋白表达量较癌旁正常组升高，而E-cadherin蛋白表达量降低，结果提示E-cadherin蛋白低表达，而TGF-β、β-catenin 和N-cadherin 蛋白高表达利用癌细胞侵袭。Pearson 相关分析结果显示，血清miR-21 和miR-119a 表达平与PI3K、AKT、CyclinD1、TGF-β、β-catenin 及N-cadherin 表达呈正相关，与PTEN 和E-cadherin 表达呈负相关，结果表明血清miR-21 和miR-119a表达水平与膀胱癌增殖、侵袭等恶性特征具有一定的联系。进一步研究发现，与低miR-21和miR-119a 表达组别比较，高miR-21 和miR-119a表达量的膀胱癌TGF-β、β-catenin、N-cadherin 的蛋白表达量较高，这说明miR-21 和miR-119a 的表达异常和癌细胞侵袭具有密切关联。张栋邦等[24]和何鹏等[25]也证实了这一结论。

综上所述，膀胱癌患者血清miR-21和miR-119a表达水平异常升高，血清中miR-21 和miR-119a 的表达水平对膀胱癌的预测具有较高的价值，并且两者表达量与相关增殖基因和侵袭基因表达高度相关，提示血清miR-21 和miR-119a 表达水平可能是膀胱癌的潜在生物标志物，对膀胱癌的发生发展及增殖、侵袭等具有重要意义。