血浆外泌体源性miR-1224-5p与溃疡性结肠炎患者炎性反应状态及预后的关系

林笑晗，贲 腾，马 林，田 尧

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种原因不明的慢性结肠炎症，具有发病率高、病程长以及反复发作等特点，已逐渐成为影响我国群众身体健康的疑难病[1]。有研究认为，早期确诊并给予治疗对改善预后具有重要意义[2]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）属于非编码单链RNA 分子，参与机体调节细胞增殖、细胞凋亡、胚胎发育等多个过程[3]。外泌体是一种携带非编码RNA、蛋白质和脂质等多种物质的小囊泡，是血浆miRNA 富集体[4]。已有研究证实，血浆外泌体源性miRNA 是预测疾病的诊治及预后的有效标志物[5]。既往已有研究发现miR-1224-5p在非酒精性脂肪性肝病的潜在治疗中发挥重要作用[6]，但目前关于血浆外泌体源性miR-1224-5p 在UC 中表达水平以及与患者预后关系的研究结果尚不清楚。因此，本研究拟分析血浆外泌体源性miR-1224-5p 与UC 患者炎性反应状态及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2018年1月-2019年10月海安市人民医院收治的103例UC患者，根据病情活动程度分为活动期组（指慢性炎细胞明显浸润，上皮内有中性粒细胞增多、伴或不伴隐窝破坏及糜烂）57例和缓解期组（指肠道黏膜无质脆、出血、糜烂、溃疡）46 例。活动期组：男性30 例，女性27；年龄25~65（43.36±3.65）岁；体质指数（21.66±3.74）kg/m2；病变位置：直肠、乙状结肠25例，左半结肠20例，全结肠12例。缓解期组：男性25例，女性21；年龄26~66（43.75±3.45）岁；体质指数（21.57±3.68）kg/m2；病变位置：直肠、乙状结肠21例，左半结肠16例，全结肠9例。本研究经我院医学伦理委员会批准。纳入标准：①UC患者均符合《中国炎症性肠病组织病理诊断共识意见》中的诊断标准[7]；②患者/家属知情同意。排除标准：①严重心肝肾功能障碍或恶性肿瘤疾病者；②存在结肠大出血等UC 相关并发症或伴有结肠狭窄、梗阻其他结肠疾病者；③近期内服用抗炎药物或免疫抑制剂药物者；④临床资料不全者。选择同期来我院体检的60 例健康人群作为对照组，男性30例，女性30例；年龄25~66（43.44±3.70）岁；体质指数（21.52±3.65）kg/m2。三组年龄、性别、体质指数比较，差异无统计学意义（F=0.162、χ2=0.205、F=0.023，P=0.851、0.902、0.978）。

1.2 方法

1.2.1 血浆采集与外泌体的鉴定 采用含EDTA 抗凝管抽取空腹外周静脉血5 mL，4 ℃静置2 h 后以3 300 g离心15 min后取上清，分装至微型离心管并并存放至-80 ℃冰箱内备用。取700 μL 血浆按外泌体试剂盒exoRNeasy Serum（美国Qiagen 公司）说明书提取外泌体，并进行外泌体鉴定。鉴定：将外泌体悬浮于无酶水中，滴200 目铜网，静置1 min 并于干燥后用1%磷钨酸染色20 s，随后待样本干燥后通过H7650 透射电镜（日本日立公司）观察外泌体形态。粒径检测：使用纳米粒径分析仪（ZETA‐SIZER Nanoseries-Nano-ZS，英国Malvern 公司）检测外泌体的颗粒大小和浓度。采用流式细胞仪（美国ABI 公司）检测外泌体标志物CD63 和CD81 表达水平。表面标志物检测：采用流式细胞仪对样本表面特异性标志蛋白CD63 和CD81 进行检测。本研究具体步骤严格按照说明书进行。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative re‐al-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测采用TRIzol试剂盒（Invitrogen公司）提取UC与健康对照组患者血浆外泌体源性RNA，使用Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit 试剂盒（Invitrogen公司）逆转录合成cDNA。通过exoRNeasy Midi试剂盒（美国Qiagen 公司）提取外泌体RNA。随后使用qRT-PCR试剂盒及AppliedBiosystems7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）进行进行qRT-PCR分析，内参为U6，上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-ACGCTTCACCGAATTTGVGA-3′。反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃、15 s，60℃、30 s，72 ℃、30 s，共计35 个循环。并利用CFX manager 3.0 软件对CT 值进行计算，用2-△△Ct计算miRNA 相对表达量。

1.3 炎性反应程度评价及分组 采用改良Baron 评分[8]评估UC 镜下炎性反应程度，评分标准：0 分（黏膜血管纹理清晰可见），1 分（轻度病变，血管纹理模糊，黏膜充血但未出血），2 分（中度病变，黏膜颗粒样变化且出血），3 分（重度病变，黏膜溃疡且出血）。采用Mayo 内镜评分（MES）[9]评估UC 临床活动度并将活动期组分为轻、中、重组，评分标准：≤2分表示症状缓解，3~5 分表示轻度活动（轻度组22例），6~10分表示中度活动（中度组19例），11~12分表示重度活动（重度组16例）。

1.4 随访 本研究所有患者出院后通过电话随访及复诊等方式进行为期2年的随访，每月随访1次，随访率100%。并在随访期间通过结直肠镜检查评估患者复发情况，根据复发情况分为复发组29 例、未复发组74 例，其中复发指黏膜愈合后再次出现UC 相关症状，如肠黏膜血管纹理不清、出血、糜烂或溃疡等。

1.5 统计学处理 采用SPSS23.0 统计学软件，计量资料以均数±标准差()表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；计数资以用例数、百分比表示，组间比较采用四格表χ2检验；采用Pearson 相关分析探讨血浆外泌体源性miR-1224-5p 与Mayo 评分、Baron 评分的相关性；同时采用多因素Logistic 逐步回归分析探讨影响UC 患者预后复发的相关因素，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外泌体鉴定结果 H7650 透射电镜下观察外泌体的直径为106 nm；纳米粒径分析仪粒径检测外泌体的平均粒径为42.2 nm，粒径分布系数为0.479；流式细胞仪检测外泌体标志物CD63 阳性表达率为86.8%，CD81 阳性表达率为63.9%。以上结果表示所提取外泌体符合正常特征。

2.2 血浆外泌体源性miR-1224-5p 相对表达量比较 活动期组UC患者血浆外泌体源性miR-1224-5p相对表达量明显高于缓解期组、对照组，缓解期组UC 患者血浆外泌体源性miR-1224-5p 相对表达量明显高于对照组（P<0.05）。表1。

表1 各组血浆外泌体源性miR-1224-5p相对表达量比较(±s)

表1 各组血浆外泌体源性miR-1224-5p相对表达量比较(±s)

与活动期组比较，*P<0.05；与缓解期组比较，#P<0.05

组别活动期组缓解期组对照组FP n 57 46 60外泌体源性miR-1224-5p 2.42±0.52 1.96±0.20*1.21±0.14*#10.126<0.001

2.3 活动期不同程度UC 血浆外泌体源性miR-1224-5p、Mayo 评分、Baron 评分比较 活动期重度组UC 患者血浆外泌体源性miR-1224-5p、Mayo 评分、Baron评分均明显高于中度组和轻度组，中度组UC 患者血浆外泌体源性miR-1224-5p、Mayo 评分、Baron评分均明显高于轻度组（P<0.05）。表2。

表2 活动期不同严重程度UC血浆外泌体源性miR-1224-5p、Mayo评分、Baron评分比较(±s)

表2 活动期不同严重程度UC血浆外泌体源性miR-1224-5p、Mayo评分、Baron评分比较(±s)

与轻度组比较，*P<0.05；与中度组比较，#P<0.05

组别轻度组中度组重度组FP n 22 19 16外泌体源性miR-1224-5p 1.96±0.25 2.50±0.50*2.96±0.58*#8.571<0.001 Mayo评分4.50±0.63 7.36±1.02*11.18±0.66*#98.300<0.001 Baron评分1.18±0.18 2.12±0.25*3.06±0.33*#27.830<0.001

2.4 活动期UC 血浆外泌体源性miR-1224-5p 与Mayo、Baron 评分相关性分析 经Pearson 直线相关分析结果发现，血浆外泌体源性miR-1224-5p 相对表达量与Mayo 评分、Baron 评分均呈正相关（均P<0.05）。见表3，图1、图2。

图1 血浆外泌体源性miR-1224-5p相对表达量与Mayo评分相关性

图2 血浆外泌体源性miR-1224-5p相对表达量与Baron评分相关性

表3 活动期UC血浆外泌体源性miR-1224-5p与Mayo、Baron评分相关性

2.5 不同预后UC 患者血浆外泌体源性miR-1224-5p 相对表达量与Mayo 评分、Baron 评分比较 57例活动期UC患者复发22例（38.60%），46例缓解期UC 患者复发9 例（19.56%），说明活动期UC 更容易复发（χ2=4.382，P=0.036）。复发组UC 患者血浆外泌体源性miR-1224-5p 相对表达量与Mayo 评分、Baron评分均明显高于未复发组（P<0.05）。表4。

表4 不同预后UC血浆外泌体源性miR-1224-5p及Mayo评分、Baron评分比较(±s)

表4 不同预后UC血浆外泌体源性miR-1224-5p及Mayo评分、Baron评分比较(±s)

组别复发组未复发组t P n 29 74外泌体源性miR-1224-5p 3.48±0.63 2.69±0.47 6.261<0.001 Mayo评分11.58±0.65 6.88±0.41 43.917<0.001 Baron评分3.28±0.30 2.35±0.22 17.340<0.001

2.6 UC 患者复发的多因素Logistic 逐步回归分析以UC 患者是否复发为因变量（否=0、是=1），以血浆外泌体源性miR-1224-5p 相对表达量、Mayo 评分、Baron评分、年龄、性别、体质指数、病变位置、病情活动程度为自变量，采用多因素Logistic 逐步回归分析结果发现，血浆外泌体源性miR-1224-5p 相对表达量、Mayo 评分、Baron 评分、活动期均为影响UC复发的危险因素（P<0.05）。见表5。

表5 UC患者复发的多因素Logistic回归分析

3 讨论

溃疡性结肠炎是临床常见的消化科疾病，主要表现为腹泻、黏液脓血便、腹痛等症状，同时发作期与缓解期交替出现或呈持续性并逐渐加重，严重时可危及患者生命，近年来UC患病率呈不断上升，被世界卫生组织列为现代难治病之一[11]。因此，为了控制疾病进展以及改善预后，早期诊断并给予治疗是目前临床关注的热点。目前关于UC发病机制尚未完全阐明，但有多数学者认为UC与基因、免疫功能及外源性物质引发的宿主反应等因素有关[12]。因此，本次研究分析血浆外泌体源性miR-1224-5p与UC患者炎性反应状态及预后的关系。

miRNA 主要由大约21~25 个核苷酸组成，是在真核生物体内发现的短序、内源启动的非编码RNA，通过转录后水平具有组织特异性的降解或抑制靶mRNA的翻译来调节基因的表达，具有参与细胞代谢、增殖、分化、凋亡、炎症和免疫应答发生，是目前早期评估多种疾病预后的生物标志物[13]。既往有研究显示，多种miRNA 表达水平与溃疡性结肠炎病程相关，并随病程呈增高趋势[14]。而miR-1224-5p 属于miRNA 众多中一员，有研究结果表明，miR-1224-5p在结直肠肿瘤中异常表达，且与临床预后相关[14]，外泌体是多囊泡体（multivesicular‐body，MVBS）与细胞膜接触融合而释放的纳米级圆形或椭圆形生物活性小囊泡，内含RNA、DNA 片段、蛋白质等多种生物活性物质，具有信息携带功能，向靶细胞传递生物信息等作用[16]。既往研究显示，外泌体miRNAs 可作为早期鉴别诊断结直肠癌患者的新型候选肿瘤标志物[17]，可能是由于血浆外泌体miRNA 相对其他来源的miRNA，由于具有易于检测、稳定性好、不易降解、有效载体等优点而逐渐成为评估疾病病情以及预后具有潜力的生物学检测指标[18]。

本次研究结果显示，活动期UC 患者血浆外泌体源性miR-1224-5p 相对表达量明显高于缓解期、对照组（P<0.05），表示血浆外泌体源性miR-1224-5p 相对表达量在UC 患者中升高。既往有研究显示，血浆外泌体源性miR-1224-5p 重症肌无力患者中表达升高[19]，与本研究结果一致。同时本研究通过活动期不同程度分组结果显示，活动期重度组UC 患者血浆外泌体源性miR-1224-5p 相对表达量明显高于中度组、轻度组（P<0.05），说明血浆外泌体源性miR-1224-5p 相对表达量能够反应UC 患者病情严重程度。为进一步验证本研究经Pearson 直线相关分析结果发现，血浆外泌体源性miR-1224-5p相对表达量与Mayo评分、Baron评分均呈正相关（均P<0.05），当外泌体源性miR-1224-5p 相对表达量升高时，Mayo 与Baron 评分也升高，说明血浆外泌体源性miR-1224-5p 与UC 患者炎症反应程度有关，可作为评估UC 病情严重程度以及炎症反应状况的生物学标志物。本次研究通过随访发现，复发组UC 患者血浆外泌体源性miR-1224-5p 相对表达量与Mayo 评分、Baron 评分均明显高于未复发组（P<0.05），说明血浆外泌体源性miR-1224-5p 与UC 患者预后存在关系。因此，为了解影响UC 患者预后的因素，本研究多因素Logistic 回归分析结果发现，血浆外泌体源性miR-1224-5p 相对表达量是影响UC 复发的危险因素，由此证实血浆外泌体源性miR-1224-5p 与UC 发生、发展以及预后有关，能够作为评估UC 预后的有效指标。

综上所述，血浆外泌体源性miR-1224-5p 相对表达量在活动期UC 患者中升高，并随着临床严重程度上升而逐渐升高，且与炎性反应程度呈正相关，同时与UC患者复发密切相关，有助于临床治疗以及改善预后情况。但是由于本次研究实验样较少，且未进行单因素分析，因此更多的研究需进一步探索。