2020—2021年冬春季铜仁市家禽高致病性禽流感专项监测

王明周， 敖芳芳， 陶沿竹， 猛 洪， 白 明， 郭义军， 陆安法， 赖 婧， 龙立书

(贵州省铜仁市动物疫病预防控制中心，贵州 铜仁 554300)

禽流感是由 A 型流感病毒引起的禽类传染性疾病，按病原体类型可分为高致病性、低致病性、非致病性3大类。非致病性和低致病性禽流感的致死率较低[1]。高致病性禽流感由A型流感病毒的H5或H7亚型引起，占我国禽流感发病数的90%以上，被世界动物卫生组织列为A类动物疫病[2]。近年来，铜仁市养殖家禽时有高致病性禽流感发生，严重威胁养禽业的发展和人民群众的生命健康。为掌握全市高致病性禽流感病毒的感染情况，切实做好高致病性禽流感预警预报工作，及时防范疫情，保障养禽业的健康发展，2020年12月至2021年3月分别在全市10个县(区)采集家禽咽肛拭子和养殖场、交易市场环境拭子进行禽流感病毒(H5、H7亚型)监测分析，现将监测情况报道如下。

1 材料与方法

1.1 样品来源按照《贵州省动物疫病预防控制中心关于印发〈今冬明春高致病性禽流感专项监测工作方案〉的通知》要求，每个县(区)随机抽检1个规模场(或种禽场)，每个场采集双棉咽肛拭子样品30份；随机抽检1个活禽交易市场(或屠宰场点)，每个场(点)采集咽肛双棉拭子样品30份及环境样品30份。全市10个县(区)共抽检13个规模场(种禽场)和9个活禽交易市场(屠宰场点)，共计890份样品。

1.2 样品采集与保存样品类型为咽肛拭子和环境拭子。在采集样品的过程中，采样人员全程穿戴一次性无菌防护服、口罩和手套，采用无菌干棉拭子和1.5 mL离心管采集鸡咽喉和肛门的分泌液。采集完成的样品4 ℃冷藏运输，于12 h内送至市中心兽医实验室-20 ℃冷冻保存。每管拭子样品加入含有5 000 IU/mL青霉素和10 mg/mL链霉素1 mL的PBS液，浸泡2 h，3 000 r/min离心15～20 s，备用。

1.3 仪器与试剂

1.3.1 主要试剂禽流感病毒H5亚型实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测试剂盒(北京森康生物技术开发有限公司，批号：Q02-003-201106)、禽流感病毒H7亚型qRT-PCR检测试剂盒(北京森康生物技术开发有限公司，批号：Q02-004-201019)、病毒DNA/RNA提取试剂盒(西安天隆科技有限公司，批号：20160810T036)。

1.3.2 主要仪器核酸全自动提取仪(西安天隆科技有限公司，型号：NP968-C)、荧光定量PCR仪(德国IBA公司，型号：7500)。

1.3.3 病毒RNA提取按照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书方法提取各样品总RNA。

1.3.4 样品检测与结果判定反应体系和扩增程序严格按照试剂盒说明书方法进行。

1.3.4.1 禽流感病毒H5亚型扩增程序(1)按照每个反应体系：qRT-PCR反应液20 mL加酶混合物1 mL，计算样品总数，对应样品总数分别分装20 mL到相应的八连管中，然后添加模板RNA溶液5 mL，总反应体系25 mL。(2)将加样后的八连管放入荧光定量PCR检测仪内，设置反应参数：第1阶段反转录42 ℃ 15 min；第2阶段预变性94 ℃ 3 min；第3阶段94 ℃ 15 s，53 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。在第3阶段每次循环的60 ℃时收集荧光信号。(3)结果判定：Ct值≥40且无特异性扩增曲线，判为阴性；Ct值≤30且出现典型的扩增曲线，判为阳性；3030则判为阳性，否则为阴性。

1.3.4.2 禽流感病毒H7亚型扩增程序(1)按照每个反应体系：qRT-PCR反应液15 mL加酶混合物1 mL，计算好各试剂的使用量，加入1个适当体积的无酶离心管中，充分混匀，每管15 mL分装八连管中，然后分别加入检测样品、阴性和阳性对照RNA溶液10 mL，总反应体系25 mL。(2)设置反应参数：第1阶段反转录42 ℃ 30 min；第2阶段预变性92 ℃ 2 min；第3阶段92 ℃ 10 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共5个循环；第4阶段92 ℃ 15 s，53 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。在第4阶段每次循环的60 ℃时收集荧光信号。(3)结果判定：Ct值≥40且无特异性扩增曲线，判为阴性；Ct值≤30且出现典型S形曲线，判为阳性；30

2 结果

由表1可见：本次禽流感病毒(H5、H7亚型)专项监测共检测13个家禽规模养殖场(种禽场)、9个活禽交易市场(屠宰场点)，检测样品共计890份，基本覆盖了全市所有县(区)，检测结果均为阴性。

表1 2020—2021年冬春季铜仁市高致病性禽流感病毒(H5、H7亚型)检测结果

3 结论

2020—2021年冬春季铜仁市10个县(区)的13个家禽规模养殖场(种禽场)、9个活禽交易市场(屠宰场点)高致病禽流感病毒(H5、H7亚型)监测结果均为阴性，发生高致病性禽流感疫情的风险较低。

4 分析与讨论

4.1防控动物疫病主要是做好3大环节的处置，即消灭传染源、切断传播途径、保护易感动物。动物调运监管在切断疫病传播途径方面具有重要意义。近年来，铜仁市不断加强对动物尤其是家禽的调运监管力度。按照新修订的《贵州省动物防疫条例》(2018年1月1日起施行)规定，我市要求屠宰、经营、运输前的家禽必须在所在地县级动物卫生监督机构申报检疫，检疫合格后需附有动物检疫合格证明，对于引种或宰杀销售的家禽必须出具高致病性禽流感等动物疫病检测合格报告，到达所在目的地后，需转运、分销的家禽必须在所在地动物卫生监督机构申报动物检疫合格证。上述家禽调运监管措施在一定程度上防止了高致病性禽流感等重大动物疫病在我市的传播。

4.2邹联斌等[3]调查研究表明，为防止外环境中高致病性禽流感的发生，必须要提高生物安全措施、做好免疫接种、加强监测和流行病学调查工作、提高兽医机构效能。近年来，我市动物疫控中心每年的春秋两防监督检查发现，各县(区)绝大多数肉鸡或蛋鸡规模场、中小养殖场对高致病性禽流感病毒(H5、H7亚型)免疫存在过度接种的现象，大多1年接种4～5次。在保护易感动物方面，免疫接种是预防高致病性禽流感最有效的1种措施。本次监测结果表明，免疫接种能够有效保护家禽对禽流感病毒的侵袭，但合理的接种次数还需进一步探索和优化。在消灭传染源方面，对饲养场地及活禽交易市场环境多频次消毒是1种有效措施。近年来，我市对活禽交易市场加强了消毒管理，对全市范围内的活禽交易市场施行“1110”管理制度，即“一天一清洗、一天一消毒、一周一扫除、每天零存栏”，多种消毒药品交替使用，如氯制剂、戊二醛类消毒药能够有效杀灭禽流感病毒。本次针对活禽交易市场的检测结果均为阴性也提示了多频次消毒能够有效消灭病原。

4.3赵婉莎、王喜云等[4，5]研究表明，活禽交易市场中家禽宰杀案板、笼具部位的高致病性禽流感病毒含量最高。本次监测按方案要求没有对宰杀案板、笼具进行采样，以后的监测方案可考虑增加此2项内容。尽管本次对环境的监测结果均为阴性，但由于冬春季是禽流感高发季节，加上部分养殖场需要补栏出苗，对高致病性禽流感的防控仍不能掉以轻心，应持续加大排查力度，及时做好免疫监测，做到“应免尽免，不足补免”。