鸡巴氏杆菌病的实验室诊断与防治

陈胜婷， 陈高永， 安 娜， 汤 莉， 李应分， 汪德生，2*

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2. 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025)

禽巴氏杆菌病又称禽霍乱，是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)引起鸡、鸭、鹅等禽类的1种接触性传染病[1]。该病在世界大多数国家均有发生，呈散发性流行，是家禽的常见疫病之一[2]。2021年7月，贵州省遵义市某养殖场的110日龄乌骨鸡发生疫情，临床症状主要为消瘦、鼻腔有黏液，2天死亡60余只。为查明鸡发病死亡的原因，特进行实验室诊断，并采取相应防治措施。

1 材料与方法

1.1 主要试剂鲜血琼脂培养基(自制)；麦康凯培养基、美蓝染色剂、革兰氏染料、药敏纸片、生化鉴定管(杭州微生物试剂有限公司)；DNA/RNA提取试剂盒、新城疫病毒qRT-PCR检测试剂盒(深圳芬德生物技术有限公司)；2 000 bp DNA Marker(博迈德生物技术有限公司)等。

1.2 主要仪器高速冷冻离心机(长沙高新开发区湘仪贝克仪器仪表有限公司)、PCR扩增仪(杭州柏恒科技有限公司)、凝胶成像仪(BIO-RAD)、实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD CFX connect)等。

1.3 流行病学调查、症状及病变该养殖场存栏乌骨鸡6万余只，鸡苗为外地引进，已进行了基本的疫苗程序免疫(肾型传染性支气管炎、传染性法氏囊病、禽流感、新城疫、鸡痘等)。2021年7月14日死亡3只，至第2天相继死亡60余只。临床检查：鸡消瘦、鼻腔有黏液。剖检病死鸡可见：肝脏表面有灰白色坏死点，心冠脂肪出血，心包内有淡黄色积液，肌胃出血，腺胃乳头出血，盲肠扁桃体出血，十二指肠弥漫性出血，肾脏肿大，胸肌和腿肌出血，肺脏有实变区。结合流行病学调查、临床症状、病理变化，病例疑似禽霍乱、新城疫或安卡拉病。

1.4 细菌检测

1.4.1 病料镜检采集病死鸡肝脏组织制成2～3个触片，火焰固定，美蓝染色5～10 min，水洗干燥后加1滴香柏油，加盖玻片，光学显微镜(100×10倍)观察。

1.4.2 细菌分离培养无菌条件下用接种环将病死鸡肝脏组织接种于鲜血琼脂培养基中，37 ℃恒温培养24 h后观察菌落生长状况。生长菌落经3次纯化培养后进行革兰氏染色，光学显微镜(100×10倍)观察细菌形态。挑取纯化的单一菌落接种于麦康凯培养基，37 ℃恒温培养24 h后观察菌落生长情况。

1.4.3 生化试验通过糖发酵试验(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇)、M.R试验、吲哚试验检测分离菌的生化特性。

1.4.4 药敏试验将纯化的细菌接种于鲜血琼脂培养基，然后将药敏纸片贴于培养基表面，37 ℃培养24 h，测量抑菌圈直径。根据杭州微生物试剂有限公司药敏判定标准判定菌株对药物的敏感性。

1.5 相关病毒核酸检测分别取9只病死鸡的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑组织病料各1 g于灭菌研钵中，加入生理盐水1.5 mL快速研磨，匀浆后转入1.5 mL 无菌离心管中，8 000 r/min离心2 min，分别移取上清液100 μL于另1支1.5 mL无菌离心管中，按照DNA/RNA提取试剂盒说明书方法提取样品的总DNA/RNA，-20 ℃保存备用。

1.5.1 新城疫病毒核酸检测以提取的总RNA为模板，构建qRT-PCR反应体系25 μL：qRT-PCR反应液17.5 μL，混合酶2.5 μL，RNA模板 5 μL。反应条件：50 ℃ 10 min，95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，55 ℃ 40 s，在循环第2步(55 ℃ 40 s)收集荧光信号，共40个循环。

1.5.2 安卡拉病毒核酸检测引物序列：FAdV-4-F：5’-CCCAAGCTTATGTCGGCCCTAATCGCCT-3’；FAdV-4-R：5’-TGCTCTAGAGGCCAAAGTATCGT CATCGATGAGCAG-3’。退火温度59 ℃，预扩增片段366 bp。以提取的总DNA为模板，构建PCR反应体系25 μL：2×TaqPlus MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，灭菌ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸5 min，4 ℃保存，取PCR产物10 μL于含Goldview核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶中电泳(110 V，40 min)，凝胶成像仪上观察结果(预扩增片段366 bp)。

2 结果

2.1 细菌检测结果

2.1.1 肝脏组织镜检发现两极浓染的短小杆菌，呈蓝色(见图1)。

图1 肝脏组织触片镜检

2.1.2 细菌形态特征由图2可见：鲜血琼脂培养基中生长出光滑湿润、灰白色、半透明、隆起、边缘整齐的露滴状菌落。挑取菌落革兰氏染色镜检，可见革兰氏阴性(红色)短小杆菌，呈单个存在或成双排列(见图3)。

图2 菌落形态

图3 分离菌革兰氏染色镜检

2.1.3 生化特性由表1可见：分离菌可发酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖，吲哚试验呈阳性，与多杀性巴氏杆菌的生化特性相符。根据细菌形态特征和生化特性，综合鉴定为多杀性巴氏杆菌。

表1 分离菌生化试验结果

2.1.4 药物敏感性由表2可见：分离菌对多西环素、四环素、新霉素、头孢拉定、诺氟沙星、庆大霉素、青霉素、丁胺卡那敏感，对环丙沙星、卡那霉素 、红霉素中度敏感。

表2 药敏试验结果

2.2 相关病毒检测结果

2.2.1 新城疫病毒核酸检测结果由图4可见：新城疫病毒qRT-PCR检测显示，9个检测样品均无明显扩增曲线且Cq值>40(阳性对照Cq值为19.5)，说明各组织样品中不存在新城疫病毒感染。

+：阳性对照；-： 阴性对照；1～9：检测样品图4 新城疫病毒qRT-PCR检测结果

2.2.2 安卡拉病毒核酸检测结果由图5可见：9个检测样品经PCR扩增，均未出现366 bp目的基因片段，与阳性对照不相符，说明组织样品中不存在安卡拉病毒感染。

M：2 000 bp分子质量标准；+：阳性对照；-：阴性对照；1～9：检测样品图5 安卡拉病毒PCR检测结果

3 结论

通过流行病学调查、临床症状、病理变化和实验室病原检测，确诊该养殖场发病原因为多杀性巴氏杆菌感染。

4 防治措施

根据药敏试验结果，选用多西环素、四环素、新霉素等敏感药物按说明书用量及方法进行治疗，并定期更换、交叉使用，避免长期使用同一种药物而使细菌产生耐药性。大群治疗通过将药物投放在饮水或饲料中给药，注意经水给药时药物要充分溶解，经料给药时要搅拌均匀。用药治疗后病情缓解，死亡数下降，数天后控制了病情，再无死亡发生。为防止再次发病，建议场主在饲养过程中要避免鸡群拥挤，保持适宜的鸡舍温度，并定期清理消毒，保证饲料、饮水和用具清洁卫生。

5 讨论

巴氏杆菌通常为条件性致病菌，大多数是内源性感染，当动物机体抵抗力下降时常引起发病。因此，对该病的防控主要以提高动物机体抵抗力和做好饲养管理工作为主。贵州气候类型为亚热带湿润季风气候，光照条件较差，降雨日数多，相对湿度较大。通风不良会使得禽舍内阴暗潮湿，易滋生细菌，使禽患病的风险加大。巴氏杆菌病的流行和发生无明显的季节性，一年四季均可发生，但在高温、潮湿、雨水较多的夏、秋季以及温度多变的春季发病率较高[3]。夏季气温高，鸡舍通风不良常导致舍内环境温度升高，导致鸡的热应激反应，感染巴氏杆菌的鸡会在短时间内出现死亡[4]。鸡舍在高温季节要保证良好的通风，以缓解高温对鸡的不良影响[5]。冬季采用最小通风量，减少热量的损失并保证能够排出废气，引进新鲜空气[6]。对于保温性能不好的禽舍，冬天可在四周、房顶处加保温层，如玉米秸秆、稻草、棉被等，防止冷风渗透[7]。此外，大部分家畜也携带有巴氏杆菌，带菌的猪、狗、猫均可能使鸡受到感染，因此家畜和家禽必须分开饲养[8]。