灵芝菌株性状稳定性试验和品比试验

李希政徐作成夏宏志朱琳张智超王宏越

(1.吉林省生物研究所，吉林 长春 130012；2.舒兰市新安乡综合服务中心，吉林 舒兰 132625)

灵芝(Ganoderma lucidum(Lesyss ex Fr.)Karst)在分类学上隶属于担子菌纲，多孔菌目、灵芝菌科、灵芝属[1]，以其较高的药用价值在医药学史上具有两千多年的历史。其子实体木质化，可以长久保存，故有“万年菌”之称[2]。在我国，灵芝有着悠久的历史，是中国中医药宝库中的一颗璀璨明珠[3]。2000年，《中华人民共和国药典》修订版首次收录赤芝为灵芝正品。据统计，2018年我国灵芝产量达到16.8万t，比2017年产量增加22.13%，是世界上灵芝的主要生产和出口国[4]。灵芝含有丰富的生物活性物质，如多糖、三萜、氨基酸、维生素、生物碱、甾醇类物质等，而多糖和三萜是其中的主要药效成分，其含量可作为衡量灵芝质量的标准[5]。灵芝多糖具有降血压、降血脂、降血糖、抗癌防癌、抗氧化、提高身体免疫力和增强体质的作用，灵芝三萜具有保肝排毒、降低胆固醇、调节血脂、抑制肿瘤细胞、抗HIV病毒和抗炎等活性。此外，灵芝还具有强精、消炎、镇痛、抗菌、解毒、利尿、净血、美容等多种功效，是当之无愧的万药之首。可见，赤芝的药用价值已经深入应用到医疗、保健上。目前，我国栽培的灵芝品种多为赤芝。但新品种选育较少，特别是吉林省栽培菌种多来源于南方，本地赤芝品种相对缺乏。通过对野生灵芝资源的选育研究，项目组成功选育出“吉芝1号”赤芝菌株，并对其进行稳定性试验，稳定其农艺性状，为该菌种的推广打下坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

“吉芝1号”赤芝(由CJ12、SW6杂交选育)、CJ12(野生菌株)、SW6(长白山菌种资源库)。

1.2 试验培养基

PDA试管加富培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蛋白胨1.5g、硫酸镁1g、磷酸二氢钾2g、维生素B11片，水1000mL，pH值自然。

原种培养料：木屑75%、麸皮18%、玉米粉5%、石灰1%、石膏1%，含水量控制在60%～65%，高压聚丙烯袋高压灭菌，袋温降至28℃左右时无菌箱或超净工作台接种。

栽培木段：以硬杂木为主，接种前15d砍伐经济林疏枝，带皮切段拼盘，含水量45%。常压聚乙烯袋100℃灭菌12h以上。木段出锅降温至28℃左右即可进行接种。

1.3 试验方法

1.3.1 稳定性试验

以CJ12和SW6为对照，采用段木栽培方式进行“吉芝1号”性状稳定性试验。试验数量为150段，3次重复，每次重复50段。每段段木湿重8kg，含水量45%。试验时间2020年和2021年。试验结果经统计学分析，说明“吉芝1号”性状稳定性。在整个试验过程中，栽培所需要的母种、原种、栽培种培养基(料)要严格按照1.2中配方进行配制，制作完成后灭菌。灭菌条件：母种培养基121～125℃灭菌20min,原种培养基121～125℃灭菌90～120min[6]，栽培种木段121℃灭菌6h闷锅一夜，第2天出锅接种。接种后，将其转入25～28℃培养室中进行暗培养。栽培种菌丝长满段木表面后，进入后熟管理，然后移至栽培棚内脱袋地埋出芝。出芝时，既要保证棚内湿度85%～90%，又要保证棚内避光，达到三分阳七分阴的出芝条件，同时还要保证温度达到28～30℃(灵芝属高温出芝真菌，低温低产)，并保证空气新鲜。在发菌期间，子实体分化、生长期间对二氧化碳敏感，应注意通风；若通风不足，二氧化碳深度超过0.1%易形成鹿角状的畸形芝[7]。前期，每天3次通风，每次15min，后期酌情将棚门一侧或两侧24h开启。当灵芝芝盖边缘白色或黄色生长圈消失并转为棕褐色，菌盖革质化，菌盖上有褐色孢子覆着时，说明灵芝子实体已经成熟，可以进行采收。从子实体产孢子开始用风机吸附法进行孢子粉采集，直至子实体采收。采收后的子实体进行分级烘干，试验采用60℃烘箱烘干法。生产上还可以用风干法、烘干房烘干法等。烘干的子实体可作为后续成分测定的原料。记录子实体产量、孢子粉产量，计算生物学效率。并对子实体菌盖厚度和菌盖直径进行测量。利用划线法测量菌丝生长速度，计算菌丝平均生长速度cm·d-1。

1.3.2 品比试验

以CJ12和SW6为对照，采用段木栽培方式进行品比试验。试验数量为150段，3次重复，每次重复50段。每段段木湿重8kg，含水量45%。试验时间2020年和2021年。试验结果进行统计分析，确定“吉芝1号”品比试验结果。品比试验栽培管理过程同1.3.1栽培管理过程。灵芝粗多糖提取依据NY/T 1676采用热水浸提法。将干燥的子实体粉碎后，称取2g，加入20mL蒸馏水充分搅拌，在90℃水浴锅中加热2.5h，然后将其6000r·min-1离心3min，取上清液5mL。剩余样品倒入10mL蒸馏水,90℃水浴加热2.5h，不断搅拌。重复离心取上清液5mL。2次离心合并共计10mL提取液。加入30mL无水乙醇进行醇提15h，离心10min,将沉淀物取出加蒸馏水定溶至50mL，使沉淀物充分溶解。利用苯酚硫酸法对灵芝粗多糖进行检测，重复3次，取平均值。三萜含量测定依据NY/SJ 339法进行提取，检测方法用香草醛-冰醋酸法。

1.3.3 数据处理

试验过程中记录所得数据运用Excel和SPSS软件进行分析处理。数据取3次重复的平均值进行计算。多糖和三萜含量(%)按照相关标准进行测定和计算。

2 结果与分析

2.1 稳定性试验结果

稳定性试验中，“吉芝1号”、CJ12、SW6 3个菌株进行试验。3个菌株菌丝长速、子实体大小、出芝率、产孢量及产量等具体数据见表1和图1。图1为菌丝长速比较。从图1可知，3个菌株2021年菌丝长速均优于2020年。3个菌株的表现相同，说明菌丝长速差别来源于栽培管理的环境控制。2021年，稳定性试验条件控制更加精确，所以整体而言，2021年灵芝菌丝长速较快。同年3个菌株间比较可知，“吉芝1号”菌丝长速最快，与CJ12和SW6之间达到显著水平。对其它指标而言，2020年，“吉芝1号”菌株子实体各项指标均优于对照CJ12和SW6；2021年，“吉芝1号”菌株子实体各项指标同样优于对照CJ12和SW6。2a栽培试验中“吉芝1号”性状相对稳定。试验结果表明，“吉芝1号”无论是生长速度，还是子实体出芝率、产量、菌盖厚度以及菌盖直径、性状都较稳定，而且比其它2个菌株具有明显的农艺性状优势。对3个菌株2a间产量进行统计学分析(T测验),计算得到P>0.05，说明“吉芝1号”产量稳定，2a产量间差异未达到显著水平；生物学效率比较见图2，“吉芝1号”2020年、2021年虽然出现差距，但对其进行差异显著性比较后发现P>0.05，2a的数据无统计学差异。分析其原因可能是2021年管理质量有所提高，环境参数控制更为精确。

图1 “吉芝1号”赤芝、CJ12、SW6 3个灵芝菌株菌丝长速比较

图2 2020年、2021年“吉芝1号”赤芝、CJ12、SW63个灵芝菌株生物学效率比较

表1 “吉芝1号”稳定性试验的农艺性状特征

2.2 品比试验结果

品比试验中，“吉芝1号”、Cj12、SW6 3个菌株进行段木栽培对比试验。3个灵芝菌株的品质指标参见表2中数据。品质检测时，子实体粗多糖含量测定依据是NY/T 1676法，三萜含量测定依据NY/SJ 339法。对表2数据进行多重比较分析(SPSS分析法)，“吉芝1号”粗多糖含量较高，在显著水平和极显著水平上，均与CJ12、SW6有明显差异。三萜含量连续2a相对较稳定，与CJ12、SW6比较，“吉芝1号”子实体三萜含量较高，在0.05水平上达到显著水平，在0.01水平均达到极显著水平。

表2 品比试验中子实体品质指标

3 讨论与结论

灵芝(赤芝)具有较高的药用价值和保健价值，其子实体产量和品质直接影响栽培户的经济收益。而灵芝产量与菌株性状稳定性紧密相关，灵芝多糖、三萜含量的高低与药用价值有直接关系。因此，观察“吉芝1号”菌株栽培中的性状稳定性和品质极为重要。通过2020年和2021年连续2a的栽培比较，可以发现“吉芝1号”在栽培中产生的性状变化。

“吉芝1号”是CJ12、SW6 2个菌株选育的新赤芝品种，在农艺性状上，“吉芝1号”具有生长快、产量高、品质高的特点，且子实体盖厚、直径大。在2020年和2021年连续的稳定性试验中，该菌株产量表现稳定，产量间无显著性差异，说明“吉芝1号”产量性状能够稳定遗传，无性状分离等不稳定性状现象。在2020年、2021年2a的品比试验中，“吉芝1号”的粗多糖和三萜含量也较其它2个菌株高，经过SPSS统计分析，差异达到显著水平。因此，“吉芝1号”具有农艺性状稳定性特征，且三萜含量较高，为相关深加工提供了可靠的菌种资源。