IL-6/JAK2/STAT3对口腔鳞状细胞癌生物学行为的影响

仝向娟，周晓，钟慧，彭子文，单振锋

(1.中南大学湘雅三医院 口腔科,湖南 长沙 410013； 2.湖南省肿瘤医院 中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院 头颈外科,湖南 长沙 410013; 3.中南大学生命科学学院,湖南 长沙 410013)

口腔鳞状细胞癌(简称口腔鳞癌)是一种不同程度的口腔鳞状分化的上皮性侵袭性肿瘤，是头颈肿瘤的主要形式之一[1]。有研究表明口腔鳞癌的发生发展与信号传导异常密切相关[2-3]。近几年，对于白细胞介素6抗体(IL-6)/蛋白酪氨酸激酶2抗体(JAK2)/信号传导和转录激活因子3抗体(STAT3)信号激活促进口腔鳞癌发展潜在的分子机制的探讨受到了极大关注[4-5]，但其对口腔鳞癌细胞具体作用机制仍然不明晰。本研究旨在通过慢病毒转染的方式建立体外高效、稳定低表达IL-6口腔鳞癌细胞系体系，进而观察口腔鳞癌细胞中IL-6的变化与JAK2和STAT3联系，以及对口腔鳞癌细胞的恶性生物学行为的影响，为口腔鳞癌的发生机制提供相关分子学证据，也为下一步口腔鳞癌的临床基因靶向干预提供重要参考。

1 资料和方法

1.1 主要仪器和试剂

PowerPac Basic垂直电泳仪(Bio-Rad,美国),180-100转膜仪(Bio-Rad,美国),FQD-96A实时荧光定量PCR仪(杭州博日科技股份有限公司),KOD-Plus-Neo高保真PCR酶购自Toyobo公司，胶回收试剂盒购自Generay公司，BamHI、EcoRI限制性内切酶、dNTP mix、T4 DNA连接酶、RNase inhibitor购自Fermentas公司，IL-6、STAT3、磷酸化信号传导和转录激活因子3抗体(p-STAT3),JAK2,磷酸化蛋白酪氨酸激酶2抗体(p-JAK),存活素抗体(Survivin),锌指转录因子抗体(Snail),细胞周期蛋白B1抗体(Cyclin B1),金属基质蛋白酶2(MMP2),钙黏附蛋白E抗体(E-Cadherin)均购自美国CST公司，血管内皮生长因子A抗体(VEGFA)购自美国Abcam公司。β-肌动蛋白抗体(β-actin)购自美国Sigma公司，人口腔鳞状细胞癌细胞株(SCC4)购自上海名劲生物科技有限公司，人口腔鳞状癌细胞株(Cal27)和人口腔角质细胞株(HOK)购自北纳创联生物科技有限公司,质粒pGMLV-SB3及相应的阴性对照质粒pGMLV-SB3-shNC购自上海吉满生物技术有限公司。

1.2 qPCR评价IL-6基因在各株细胞中的表达

使用含10 %胎牛血清DMEM完全培养基分别培养Cal27、SCC4和HOK细胞，并置于CO2细胞培养箱中37 ℃培养。Trizol提取各组细胞的总RNA，然后将各组细胞的总RNA逆转录成相应的cDNA，通过 SYBR Green Master Mix 进行qPCR检测各组细胞中IL-6基因和内参基因GAPDH的表达量见表1。

1.3 IL-6 shRNA表达质粒构建

利用shRNA设计软件设计4条针对人IL-6基因的shRNA靶点和1条阴性对照(NC)序列见表2。单链寡核苷酸片段退火形成双链DNA见表3，退火产物与经BamHI和EcoRI双酶切的pGMLV-SB3载体进行连接，4 ℃过夜。将连接产物转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞中，37 ℃培养过夜。

表2 4条IL-6 shRNA靶点序列信息及阴性对照序列信息

表3 IL-6基因特异性shRNA序列信息

1.4 慢病毒感染口腔鳞癌细胞构建稳定株

具体分组如下：①Con组：未感染慢病毒的Cal27细胞和SCC4细胞；②NC组：感染pGMLV-SB3-shNC慢病毒的Cal27和SCC4细胞；③IL-6shRNA1(sh1)组：感染pGMLV-SB3-IL-6shRNA1慢病毒的Cal27细胞和SCC4细胞；④IL-6shRNA2(sh2)组：感染pGMLV-SB3-IL-6shRNA2慢病毒的Cal27细胞和SCC4细胞；⑤IL-6shRNA3(sh3)组：感染pGMLV-SB3-IL-6shRNA3慢病毒的Cal27细胞和SCC4细胞；⑥IL-6shRNA4(sh4)：感染pGMLV-SB3-IL-6shRNA4慢病毒的Cal27细胞和SCC4细胞。在感染16 h后更换成培养基，CO2细胞培养箱中37 ℃培养，48 h后选择嘌呤霉素真核抗性筛选细胞，利用qPCR方法和Western blot方法检测IL-6基因敲低效果。

1.5 CCK8实验

配置细胞悬液：取对数期生长期的Cal27/SCC4 Con、Cal27/SCC4 NC、Cal27/SCC4 IL-6shRNA1/3，分别命名为Con组、shRNA NC组、shRNA1/3组。每个细胞单块96孔板接种3个孔，接种4块板子，每孔接种100 μL细胞悬液，加入10 μL CCK8溶液，酶标仪检测450 nm波长吸光度值；剩下板子分别在培养24、48、72 h后进行同样操作。

1.6 克隆形成实验

每皿约300个细胞的密度接将细胞种于6孔板中。CO2细胞培养箱中，37 ℃培养2周。结晶紫染色液染色15～30 min。用流水清洗掉结晶紫染色液，将细胞培养板置于空气中干燥，用相机对培养皿进行拍照，计算各孔中的克隆数目。

1.7 流式细胞术检测

各组细胞并将其收集于无菌EP管中，加入400 μL 100 μg/mL的PI染液，在室温下避光染色约30 min。用流式细胞仪进行荧光信号检测，激发波长设置为488 nm。

1.8 Transwell迁移和侵袭实验

在细胞小室的上室中加入100 μL细胞悬液(约含5×103个细胞)，下室中DMEM完全培养基或加入Matrigel基质胶的培养基，培养24 h。加入结晶紫染色液，室温下静置15 min。用PBS清洗细胞3次，然后用棉签轻轻擦去小室滤膜上表面的细胞，置于空气中干燥，镜下选取3个视野计数，取平均值算出穿过的细胞数目。

1.9 qPCR检测各组细胞中基因表达状况

提取细胞样本总RNA，逆转录cDNA，利用qPCR法检测各组细胞中E-Cadherin、CyclinB1、MMP2、VEGFA、Snail和STAT3基因表达情况见表4，以GAPDH基因作为内参。为了减少误差，所有检测样本均做3个平行复孔，qPCR检测完成后，取3个平行复孔的平均值作为该样本的最终检测数值。

表4 各目的基因及GAPDH基因的qPCR检测引物序列

1.10 蛋白质印迹法

蛋白样品上样到SDS-PAGE胶加样孔内。先用80 V约30 min使溴酚蓝到达浓缩胶和分离胶分界线后，调电压至120 V。电泳1.5～2 h后，终止电泳并进行转膜。封闭，一抗孵育，二抗孵育用TBST溶液洗膜3次，每次10 min。使用Tanon4600荧光图像分析系统显影。并用imageJ软件读取各条带的灰度值，进行定量分析。

1.11 统计学方法

SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，Shapiro-Wilk检验数据正态分布，用单因素方差分析比较多组之间差异，应用GraphPad Prism7.0软件绘图，以双侧P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-6 shRNA干扰载体的测序结果

合成4个IL-6shRNA与设计4个靶基因序列完全一致，证明退火后合成片段已完整插入了质粒中，而且没有单个碱基突变，表明成功构建了4个针对人IL-6基因的shRNA表达质粒，分别命名为IL-6shRNA1,IL-6shRNA2,IL-6shRNA3,IL-6shRNA4，见图1。经过比对，重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列完全一致，因此载体构建成功。

图1 pGMLV-SB3-IL-6shRNA质粒测序峰图(部分) a:IL-6shRNA1质粒测序峰图; b:IL-6shRNA2质粒测序峰图; c:IL-6shRNA3质粒测序峰图; d:IL-6shRNA4质粒测序峰图 注：通过Chromas LIFE VerSion2.01软件读出测序后的峰图，截取部分图。

2.2 IL-6基因在各细胞株中的本底表达结果

对Cal27、SCC4进行IL-6基因表达的检测，与HOK细胞株相比，Cal27细胞株和SCC4细胞株中的IL-6表达显著升高，差异具有统计学意义(F=12.89，P=0.012，P<0.05)，其中Cal27细胞株中的IL-6表达量比对照HOK细胞组高出4～5倍，见图2。

图2 IL-6基因在各细胞株中的本底表达结果 a:HOK细胞; b:SCC4细胞; c:Cal27细胞; d:3组细胞中IL-6基因的表达 注：**P<0.01,*P<0.05 vs.HOK。

2.3 建立稳定的IL-6敲低的口腔鳞癌细胞株

将IL-6shRNA1,IL-6shRNA2,IL-6shRNA3,IL-6shRNA4质粒以及相应阴性对照质粒pGMLV-SB3-shNC分别转染至Cal27细胞和SCC4细胞中，得到稳定转染细胞后，收集各组细胞，对各质粒的沉默效果进行qPCR，Western blot验证。结果显示，在Cal27细胞中4个质粒均不同程度的干扰IL-6蛋白的表达，表明基因敲除的细胞模型构建成功，其中IL-6shRNA1质粒干扰结果较明显((F=92.51，P=0.000)，因此，选择IL-6shRNA1靶点进行后续的相关实验。在SCC4细胞中4个质粒均不同程度的干扰IL-6蛋白的表达，表明基因敲除的细胞模型构建成功，其中IL-6shRNA3质粒干扰结果较明显(F=116.70，P=0.000)，因此，选择IL-6shRNA3靶点进行后续的相关实验，见图3。

图3 IL-6敲低的稳定细胞株的构建与验证 3a:质粒感染Cal27细胞的效果图; 3b:质粒感染SCC4细胞的效果图; 3c:Western blot法验证质粒感染Cal27细胞后IL-6蛋白的干扰效果; 3d:Western blot法验证质粒感染SCC4细胞后IL-6蛋白的干扰效果 注：**P<0.01 vs.Con，NC。 图4 Con组、NC组及IL-6sh组口腔鳞癌细胞增殖曲线 4a:Cal27细胞系实验组与对照组的比较; 4b:SCC4细胞系实验组与对照组的比较 注：**P<0.01 vs.NC，Con。

2.4 CKK8和克隆形成实验结果

IL-6基因表达下调后，口腔鳞癌细胞增殖能力在72 h受到了显著抑制，差异具有统计学意义(Cal27细胞系实验组与对照组比较，差异具有统计学意义(F=13.09，P=0.006)；SCC4细胞系实验组与对照组比较，差异具有统计学意义(F=333.97，P=0.000)，见图4。克隆形成实验结果亦显示，IL-6基因表达下调后，实验组细胞克隆数对照组明显减少，Cal27Con、Cal27NC、Cal27 IL-6shRNA1分别为(119±4)、(137±7)、(91±5)个；SCC4 Con、SCC4 NC、SCC4 IL-6shRNA3分别为(154±6)、(143±5)、(115±5)个，两组比较差异具有统计学意义(Cal27各组：F=53.73，P=0.0001；SCC4各组：F=42.31，P=0.0003)，见图5。

图5 克隆形成实验检测IL-6敲低后口腔鳞癌细胞增殖能力的改变 a:各组细胞的细胞克隆形成情况; b:Cal27细胞系实验组与对照组的比较; c:SCC4细胞系实验组与对照组的比较 注：**P<0.01 vs.NC，Con。

2.5 流式细胞学检测结果

与对照组细胞相比，感染pGMLV-SB3-IL-6shRNA1慢病毒的Cal27细胞中，G1期和S期细胞所占比例无显著性差异，而G2期细胞所占比例上升的趋势。感染pGMLV-SB3-IL-6shRNA3慢病毒的SCC4细胞组中，SCC4 Con、SCC4 NC、SCC4 IL-6shRNA3的G1期细胞所占比例分别为(48.67±0.94)%、(46.40±1.11)%、(36.35±3.47)%，显著下降(F=45.68，P=0.000)，而G2期细胞所占比例分别为(15.40±2.66)%、(19.68±2.48)%、(23.73±3.87)%显著上升(F=5.53，P=0.044)，见图6。

图6 流式细胞术检测IL-6敲低后口腔鳞癌细胞周期情况 a:各组细胞的细胞周期图; b:Cal27细胞系实验组与对照组的比较; c:SCC4细胞系实验组与对照组的比较 注：*P<0.05 vs.NC，Con。

2.6 Transwell实验结果

取对数生长期Cal27/SCC4 Con、Cal27/SCC4 NC、Cal27/SCC4 IL-6shRNA1/3，配置细胞悬液，利用Transwell实验检测各组细胞迁移侵袭能力。结果显示，在48 h内，Cal27Con、Cal27NC、Cal27 IL-6shRNA1迁移侵袭的细胞数与SCC4 Con、SCC4 NC、SCC4 IL-6shRNA3迁移侵袭的细胞数比较，敲低IL-6的口腔鳞癌细胞细胞侵迁移袭能力明显下降，差异具有统计学意义(Cal27各组：F=23.59/53.11，P=0.000/0.000；SCC4各组：F=73.39/38.73，P=0.000/0.000)，见图7、8。

图7 抑制IL-6基因表达对口腔鳞癌细胞侵袭能力的影响 a:各组细胞的Transwell细胞侵袭实验图 (结晶紫 ×40); b:Cal27细胞系实验组与对照组的比较; c:SCC4细胞系实验组与对照组的比较 注：*P<0.01 vs. Con，NC。

2.7 qPCR和蛋白质印迹实验

由qPCR结果可知，比较Cal27/SCC4 Con、Cal27/SCC4 NC、Cal27/SCC4 IL-6shRNA1/3，STAT3(F=45.30/34.58，P=0.000/0.001)、VEGFA(F=28.18/43.41，P=0.001/0.000)、Cyclin B1(F=18.11/5.41，P=0.003/0.045)、MMP2(F=66.91/18.47，P=0.000/0.030)、Snail(F=1.91/10.88，P=0.03/0.01)基因表达均随之明显下降，而E-Cadherin(F=176.92/97.17，P=0.000/0.000)基因表达随之显著增加，差异均具有统计学意义(P<0.05)。Western blot显示IL-6蛋白表达下调后，p-JAK、p-STAT3、VEGFA、Cyclin B1、JAK2、Survivin、Snail蛋白表达均随之明显下降，而E-Cadherin蛋白表达随之增加，见图9。

图8 抑制IL-6基因表达对口腔鳞癌细胞迁移能力的影响 a:各组细胞的Transwell细胞迁移实验图 (结晶紫 ×40); b:Cal27细胞系实验组与对照组的比较; c:SCC4细胞系实验组与对照组的比较 注：*P<0.01 vs. Con，NC。

图9 IL-6敲低的口腔鳞癌细胞中各蛋白表达 a:qPCR检测Cal27各组细胞中各基因表达状况; b:qPCR检测SCC4各组细胞中各基因表达状况; c:Western blot法检测Cal27 各组各因子表达情况; d:Western blot法检测SCC4各组各因子表达情况 注：*P<0.05，**P<0.01 vs.Con，NC。

3 讨论

本研究发现在口腔鳞癌中下调IL-6基因表达后，口腔鳞癌的细胞增殖、细胞侵袭及细胞迁移能力均受到了明显的抑制，细胞周期发生了G2期阻滞，表明IL-6基因的表达变化能够显著影响口腔鳞癌的各种细胞表型，这提示IL-6基因可能与口腔鳞癌的发生、发展密切相关，其可能在口腔鳞癌的发病过程中起着关键作用。

在确认IL-6基因表达变化能够影响口腔鳞癌各细胞表型后，本研究根据IL-6基因表达下调后口腔鳞癌细胞表型的变化情况，参考相关文献[6-9]，选取了STAT3、JAK2、VEGFA、CyclinB1、MMP2、Snail、Survivin、E-Cadherin等基因作为待选的IL-6可能调控的下游通路基因作为研究对象。结果显示，在口腔鳞癌中，IL-6基因表达下调后，STAT3、JAK2、VEGFA、CyclinB1、MMP2、Snail、Survivin基因表达均随之明显下降，而E-Cadherin基因表达随之显著增加，表明IL-6基因与这些下游通路基因之间存在着动态联系和密切相关性，IL-6基因可能是通过调控这些基因的表达而影响口腔鳞癌的各种细胞表型。

有研究发现IL-6主要是靠激活JAK2和STAT3使其发生磷酸化而发挥作用。当JAK2和STAT3持续激活即p-JAK2和p-STAT3表达持续升高，则会造成下游相关的基因出现异常的高表达，从而促进肿瘤细胞增殖，抑制凋亡，促进细胞的侵袭和迁移等[10-11]。例如Prasad等[12]报道活化的STAT3可以通过调控Survivin、VEGF等基因而影响结肠癌细胞周期及促进肿瘤血管生成；Tsareva等[13]发现活化的STAT3和JAK2即p-JAK2/p-STAT3可以通过调控MMPs来增强结肠癌细胞侵袭能力；Colomiere等[14]报道活化的STAT3可以促进卵巢癌细胞EMT表型转化，从而影响卵巢癌细胞的侵袭和迁移；Sulkowska等[15]报道p-STAT3可以通过促进Bcl-xL蛋白表达、抑制E-Cadherin蛋白表达而增强乳腺癌细胞侵袭和转移能力。本课题研究结果显示，在人口腔鳞癌中，发现p-STAT3的表达与IL-6基因的表达存在动态联系，因此，结合文献资料可以推测，在IL-6调控口腔鳞癌细胞表型的过程中，活化的STAT3即p-STAT3是一个关键中继节点，IL-6可能就是通过活化JAK2,进而激活STAT3，进而影响下游众多基因，从而影响口腔鳞癌的细胞增殖、侵袭以及迁移。

本研究发现在口腔鳞癌中下调IL-6基因表达后，细胞中VEGFA、CyclinB1、Survivin基因表达亦随之明显下降。因此，根据前述的VEGFA基因和CyclinB1基因的功能，以及口腔鳞癌中IL-6基因表达与VEGFA、CyclinB1基因和Survivin表达的动态联系，推测IL-6基因可能是通过IL-6/JAK2/STAT3信号通路调控CyclinB1基因、Survivin基因以及VEGFA基因的表达，进而影响口腔鳞癌细胞周期和细胞增殖。此外，MMP2等可能也能够通过介导E-cadherin蛋白外域脱落而减弱E-cadherin的作用。本研究还发现在口腔鳞癌细胞中下调IL-6基因表达后，细胞中MMP2、Snail基因表达随之明显下降，而E-Cadherin基因表达随之显著增加，因此可以推断，IL-6基因可能是通过IL-6/JAK2/STAT3信号通路调控MMP2、Snail及E-Cadherin基因的表达，进而影响口腔鳞癌侵袭和迁移。

综上所述，本研究发现在口腔鳞癌中下调IL-6基因表达，可能诱导口腔鳞癌细胞周期发生G2期阻滞，并且显著抑制口腔鳞癌细胞的细胞增殖、细胞侵袭及细胞迁移能力。进而探讨IL-6基因影响口腔鳞癌细胞表型的具体作用机制，发现在口腔鳞癌细胞中，IL-6可能主要是通过IL-6/JAK2/STAT3信号通路发挥作用，其可能是通过活化JAK2/STAT3，进而调控下游的VEGFA、CyclinB1、MMP2、Snail、Survivin、E-cadherin等基因，从而影响口腔鳞癌的各种细胞表型。IL-6/JAK2/STAT3信号通路可能与口腔鳞癌的发生、发展密切相关，其可能在口腔鳞癌的发病过程中起着关键作用，IL-6/JAK2/STAT3信号通路具有作为口腔鳞癌基因治疗靶点的潜在价值，有必要进行更深入的研究。