长链非编码RNA在变应性鼻炎中的生物学机制研究进展

王宇婷，王嘉玺

(北京中医药大学东方医院 耳鼻咽喉科，北京 100078)

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)属于机体免疫系统疾病，是鼻科常见病，且发病率随着人群生活压力增加及环境污染逐年增加，而对其机制的研究仍有不足之处。表观遗传学的研究使我们对免疫系统疾病有了更深入的认识， 长链非编码RNA (long non-coding RNA，lncRNA)是表观遗传学研究领域中的热点。本文从AR相关lncRNA表达谱差异分析及lncRNA在AR生物学中的功能两方面，对近年来的研究进展作一综述。

1 LncRNA简介

1.1 LncRNA的定义

DNA元素百科全书项目是继人类基因组计划的后续计划，其中“全基因组转录的研究”结果显示，哺乳动物70%以上的基因组序列具有转录为RNA的功能，而这其中具有蛋白质编码功能的基因占整个基因组的2%，其中大部分是不具有蛋白编码功能的非编码 RNA[1]。LncRNA最初的定义是指长度>200 nt但不具蛋白质编码功能的非编码RNA，是RNA聚合酶II转录的副产物，起初被认为是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能。随着测序技术的进步，成千上万的lncRNA被发现，对于其功能的研究日益完善。LncRNA存在于细胞核内或胞浆中，有复杂的亚细胞定位，在多种层面上调控基因的表达[2]。越来越多的研究表明lncRNA在许多复杂疾病(如癌症、免疫性疾病及神经系统疾病等)中异常表达，具有促使或抑制疾病发生及发展的作用[3-5]。

1.2 LncRNA的来源

LncRNA可以从基因组的基因间、外显子或远端蛋白质编码区转录，然后经历选择性剪切形成。lncRNA 主要位于基因组中保守性较差的区域，包括基因的内含子区域，但与lncRNA的序列相比，lncRNA的启动子区域更加保守[6]。一些 lncRNA 中开放阅读框的存在使得这些分子难以与蛋白质编码 RNA 区分开来[7]。LncRNA来源并不清楚，目前研究认为lncRNA可能由以下4种来源所产生[8]，包括蛋白质编码基因的突变、染色体重排、lncRNA 序列中邻近结构单元重复及转座元件插入。

1.3 LncRNA的分类

按与蛋白质编码基因的位置关系进行分类：根据lncRNA与染色体上编码基因的相对位置，可将其分为以下5类[9]:正义型、反义型、双向型、内含子型及基因间型。按调控方式功能进行分类：LncRNA可通过与DNA、RNA、蛋白质分子或miRNAs等相互作用[10]，发挥其作为信号、分子诱饵、分子支架和顺式及反式导向作用的功能来调控基因表达[9]。LncRNA作为信号可调控下游基因转录，且不涉及蛋白质翻译，可快速做出反应；作为分子诱饵，lncRNA可以与蛋白质结合阻断信号通路或发挥内源竞争RNA机制，结合微小RNA发挥调控作用；作为分子支架，又可称为中心平台，使多个转录因子结合到一个lncRNA，实现不同信号通路间信息的交汇与整合；导向作用既是lncRNA诱导蛋白复合物定位到指定的DNA序列，包括顺式与反式调控机制，即直接作用于DNA序列或通过产生能远距离作用的可扩散物质影响基因表达两种方式。最终实现在转录水平，转录后水平及表观修饰水平3个层面的调控，其中表观遗传修饰又包括DNA甲基化、组蛋白修饰调节染色质结构。

2 lncRNA在AR中的功能

最近，lncRNA在免疫调节方面也引起重视，这意味着lncRNA可能也参与变应性疾病的调节。AR属于机体免疫系统疾病，其特征在于暴露于变应原后在鼻黏膜中诱导炎症反应。炎症反应包括IgE介导的肥大细胞脱粒，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞和T细胞募集[11]。从免疫学角度来看，AR是外界因素诱导机体出现异常的免疫反应，导致1型辅助性T(Th1 cell，Th1)细胞/2型辅助性T(Th2 cell，Th2)细胞免疫反应平衡破坏引起的。一般情况下Th0细胞(Th0 cell)会按一定比例向Th1细胞和Th2细胞分化，两者处于相对平衡状态[12],Th1细胞产生的细胞因子白细胞介素 (interleukin，IL)-2、IL-12和γ-干扰素(IFN-γ)等能够抑制Th0细胞向Th2细胞分化，Th2细胞产生的IL-4、IL-5、IL-9和IL-13等细胞因子能够抑制Th1细胞的生成。AR既是以鼻黏膜Th2型免疫反应为主的变态反应性疾病。近年来，有学者认为lncRNA与AR的发生密不可分，AR患者及小鼠模型与正常组具有显著差异的lncRNA，甚至lncRNA可能参与某些特定的生物学过程或信号通路，调控靶基因，通过影响Th1/Th2免疫平衡，从而调控AR的发生和发展。

2.1 AR相关lncRNA的表达谱差异分析

目前lncRNA在AR中的研究刚刚进入发展阶段，对于AR相关lncRNA表达谱差异基因分析方面，样本的来源、取材部位、检测方法、差异基因的筛选标准、功能分析的模式以及lncRNA表达量检测方法的不同都使我们能够从不同角度，不同维度认识AR，为疾病的发病机制的深入了解、诊断手段的改善及治疗提供帮助。

LncRNA的检测方法主要有4种[13-14]：微阵列芯片、RNA和染色质免疫沉淀法、覆瓦式微阵和高通量测序技术。目前在研究AR中主要应用微阵列芯片及高通量测序技术，微阵列芯片具有其鲜明的优缺点，优点在于研究成本低，较高通量测序简单易操作，缺点在于其只能对已知的lncRNA进行识别，不能探索未知的lncRNA，同时也不能识别不同的可变剪接体，但随着研究的发展，更多的lncRNA被发现并确认，芯片不断更新，微阵列芯片研究也会随之提高，故其被许多研究作为首选方法。高通量测序技术在近年来发展迅速，基于二代测序在检测lncRNA的同时可进行定量分析，同时可发现已知基因的新的可变剪切及新lncRNA等，因此该方法被用于发现未知的lncRNA，该方法具有高通量、高灵敏度及低噪声等优点，随着检测费用的降低，将成为研究lncRNA的主要方式，具体见表1。

各个研究中样本来源及取材部位的不同使AR的研究更加丰富。①患者：有研究将AR患者作为研究对象，取材部位常分为两大类，鼻黏膜组织及外周血，外周血中又有全血[15]、树突状细胞(dendritic cells，DCs)[16]及单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)[17]3种lncRNA表达谱差异分析的研究。DCs 是最重要的向T细胞发送信号的抗原呈递细胞，主要参与许多具有免疫调节机制疾病的发病机制，如AR。DC将先天性和适应性免疫反应联系起来[18]。单核细胞衍生DCs的lncRNA 和 mRNA 表达谱分析证明了参与 AR 中单核细胞衍生DCs介导调节的功能网络。这些结果为了解单核细胞来源的DCs在免疫调节功能中的分子机制提供了可能，为AR的分子治疗靶点奠定了基础。PBMCs 包括淋巴细胞、单核细胞和 DCs。AR患者与健康人群全血的lncRNA表达谱差异分析较PBMC及DCs lncRNA表达谱差异分析对临床诊断标志物的研究更具优势，因其标本的取得与处理较DCs更为简便。另有研究选取AR患者鼻黏膜样本作为研究对象,同时研究的纳入标准亦有不同，有研究针对尘螨单一过敏的AR患者[19-20]，也有针对常年性AR患者[21]的研究；②AR小鼠模型：卵清蛋白(ovalbumin，OVA)诱发的AR小鼠模型是AR实验研究的经典模型，故OVA小鼠鼻黏膜[22]及脾脏分离的免疫细胞CD4+T 细胞[23]成为lncRNA表达谱分析的研究对象。总之，不同样本来源的研究使得人们从不同角度对AR发病机制有了更深入的了解。具体见表1。

表1 AR相关lncRNA表达谱差异分析的研究总结

不同研究方案得到不同的差异lncRNA基因数目，从数十到上千个差异lncRNA及mRNA被检测到，结果显示差异基因分布在多条染色体上，这些染色体都参与了AR的发生发展，证明AR的发病机制非常复杂[23]。分析得到的差异基因经qRT-PCR验证，结果与微阵列分析的结果一致。

所有研究都对检测到的lncRNA进行了lncRNA-mRNA互作网络分析，lncRNA-mRNA间调控是多对多的关系，单个lncRNA可以调节多个编码基因的mRNA表达，一些lncRNA可以共同调节同一基因的表达[21]。依据lncRNA的反式调控机制确立了lncRNA-TF-mRNA调控网络，发现LPP反义长链非编码RNA-2(lncRNA LPP antisense RNA-2，LPP-AS2)是在目标mRNA的反式调节中最具潜力的调节性lncRNA[19]。另外有研究通过对差异lncRNA进行转录因子(transcription factors，TF)预测分析，HIT000095414_04、ENST00000456563.1、ENST00000445003.1、ENST00000609268.1 以上4个lncRNA相关的TF是Pax-4、Nkx2-5、Oct-1、HNF-1、HNF-4、NF-κB、FOXD3、USF、AP-1 和 c-Rel[19]。

LncRNA的潜在功能通过其共表达mRNA的基因功能富集分析(gene ontology，GO)和通路途径注释来预测。GO类别是生物过程、分子功能和细胞成分。GO分析结果主要与炎症反应、免疫功能障碍、细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞粘附、粘着斑、细胞外基质、T细胞受体复合物、肌动蛋白细胞骨架的调节等生物学功能有关。通路分析中许多通路与免疫细胞的激活或抑制有关，例如Fc epsilon RI信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路、白细胞介素信号通路等。如付维等研究发现Rho三磷酸酶对肌动蛋白细胞骨架的调节参与AR的组织重塑[24]，该过程关键的信号分子Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶的基因C9orfl17表达有上调，经GO和通路分析与之相关的IncRNA共20种[20]。

2.2 LncRNA在AR生物学中的功能

AR的lncRNA表达谱差异基因分析的研究让我们对AR相关lncRNA有了初步认识，将差异基因及相关mRNA进行功能研究仅仅停留在数据库验证阶段，仍需进一步实验验证。故部分学者对AR相关lncRNA的生物学功能进行研究，现将lncRNA在AR患者及小鼠模型上调及下调表达进行分类，报道如下。

2.2.1 在AR中表达上调的lncRNA及其功能研究 ①LncRNA ANRIL(又称CDKN2B-AS1)：是一种在染色体 9p21 区域编码的3.8k nt的非编码 RNA，其在气道及肺组织中的表达含量较高，且与多种炎症介导的疾病有关[25-26]。在对AR患者及非AR患者鼻黏膜组织的研究中[27]，结果与对照组相比，AR患者鼻黏膜中的 lncRNA ANRIL 表达上调，且表达水平与总鼻症状评分(total nasal symptom score, TNSS)呈正相关，既与AR严重程度呈正相关。研究同时检测的鼻黏膜组织中细胞因子的表达情况，结果显示lncRNA ANRIL 表达与α-干扰素(IFN-α)、IL-4、IL-6、IL-13和IL-17呈正相关，而与IL-10和IFN-γ呈负相关，因此，lncRNA ANRIL 可能参与了 AR 的炎症调节。并且结合前人的研究，推测发挥作用的机制可能为ANRIL发挥其调节miRNA的作用，如吸附miR-181b，使IL-6、IL-8和TNF-α上调[28]或通过结合 ANRIL转录因子上调炎症因子的表达[29]，介导AR的发生。同时Liu等[30]在细胞水平上验证了lncRNA ANRIL的作用机制，用IL-13处理人鼻上皮细胞(human nasal epithelial cells，HNECs)，在体外模拟AR，应用qRT-PCR 和蛋白质印迹分析检测ANRIL、microRNA (miR)-15a-5p、JAK2、黏蛋白5AC、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、eotaxin-1及JAK2、STAT3和磷酸化STAT3的mRNA表达水平；ELISAs检测细胞上清液中炎性细胞因子和黏蛋白的分泌水平。双荧光素酶报告基因检测来确认 ANRIL 的下游靶标和 miR-15a-5p 的靶基因。结果表明ANRIL的基因敲低可能通过调节 miR-15a-5p/JAK2 轴来抑制 IL-13 处理的HNECs中炎性细胞因子和黏蛋白的产生。验证了ANRIL通过调节miRNA影响下游靶基因, 从而影响各种生物过程的调节机制；②LncGAS5：lncRNA及环状RNA(circRNA)均可以作为 ceRNA来调节基因表达，而最近的研究发现circRNAs、lncRNAs和miRNAs可以通过三者之间的相互作用来发挥调控机制。LncRNA 生长阻滞特异性5 (lncrna growth arrest specificity5，lncGAS5)，其基因位于染色体1q25.1区域，是第一个在生长停滞的成纤维细胞蛋白小鼠中发现的[31]。Zhu 等[32]首先在AR患者和OVA诱导 AR 小鼠的鼻黏膜样本中发现lncGAS5和环状同源域相互作用蛋白激酶3(circus homeodomain interacting protein kinase 3，CircHIPK3)较正常组表达增高，且敲除两者之一可减轻 AR 小鼠的鼻部症状。接下来在细胞水平上验证了lncGAS5和CircHIPK3都促进了OVA 诱导的CD4+T细胞的Th2分化，即GATA3和IL-4的表达，同时，通过荧光素酶报告基因检测及RNA pull-down实验说明CircHIPK3和LncGAS5可以直接和特异性地与miR-495相互作用。最终的研究结果表明CircHIPK3 和 LncGAS5 通过调节共同靶标 miR-495 促进 Th2 分化并加重 AR。CircHIPK3/lncGAS5 敲低慢病毒的鼻内给药通过下调GATA-3减少AR症状，为治疗AR 提供了潜在的治疗靶点。

外泌体是几乎所有类型的细胞都会分泌的纳米囊泡[33],外泌体的主要功能是“细胞间通讯”，将蛋白质、DNA、mRNA 和非编码 RNA (non-codingRNA，ncRNA) 等活性分子从一个细胞转移到另一个细胞[34]。 Zhu等[35]假设鼻上皮来源的外泌体包裹lncGAS5，并将其转运到CD4+T细胞中，通过抑制Th1分化和增加Th2分化促进变态反应。在这项研究中，从AR患者鼻黏液 和OVA刺激的鼻上皮细胞中分离的外泌体中检测到lncGAS5的表达，并验证了lncGAS5可能通过调节EZH2表达间接调节T-bet表达，从而抑制 Th1 分化并促进 Th2 分化，证实AR上皮衍生的外泌体中的lncGAS5是Th1/Th2分化的关键介质；③LncRNA NEAT1：核旁散斑组装转录本1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT1)位于染色质11q13.1区域编码的4kb的ncRNA，NEAT1保留在细胞核中，形成paraspeckle亚细胞器的核心结构成分。它可以作为许多基因的转录调节因子，包括一些参与癌症进展的基因[36]。Wang等[37]研究70例AR患者及70例非特应性阻塞性打鼾患者的鼻黏膜样本，应用逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测方法及酶联免疫吸附试验(ELISA)测定发现与对照组相比，AR患者的lncRNA NEAT1上调，而其靶基因miR-21、miR-124和miR-125a下调。同时收集患者的临床特征，包括INSS 评分、TNSS评分及相关炎症细胞因子IL4、IL-6、IL-10及IL-17等，发现lncRNA NEAT1及其靶标(miR-21 和 miR-125a)与AR的疾病风险、严重程度和炎症密切相关，表明lncRNA NEAT1具有作为AR评估生物标志物的潜力。

2.2.2 在AR中表达下调的lncRNA及其功能研究 ①FOXD3反义RNA1(FOXD3 antisense RNA1，FOXD3-AS1)：LncRNA除了促进Th2分化功能以外，亦有抑制Th2分化的功能。Ma等[21]学者进行高通量测序研究发现AR患者鼻黏膜中lncRNA FOXD3-AS1较健康人显著降低。FOXD3-AS1位于染色体1p31.3区域，又称FOXD3启动子相关反义lncRNA，属反义lncRNA。Zhang 等[38]进一步研究证实FOXD3-AS1在AR患者鼻黏膜中下调，并在细胞水平验证其机制为抑制鼻上皮细胞中IL-25的表达和分泌，从而抑制AR中的Th2细胞的表达；②长链基因间非编码RNA632(long intergenic non-protein coding RNA 632，LINC00632)： LINC00632又称ASINC，位于染色体Xq27.1区域。Yue 等[39]研究发现在AR患者的鼻黏膜组织和IL-13处理的鼻上皮细胞中LINC00632表达降低，并在细胞水平上验证LINC00632通过靶向miR-498 并负调节其表达，降低其靶基因IL1RN的表达，从而调节IL-13诱导的GM-CSF、嗜酸性粒细胞趋化因子和 MUAC5AC等的表达。

LncRNA在AR中的研究仍有很大空间，目前lncRNA功能研究主要是对Th1/Th2免疫反应失衡的影响，然而人体免疫系统非常庞杂，AR相关免疫细胞及细胞因子仍有许多，如巨噬细胞、固有淋巴细胞、调节性T细胞等等，那么lncRNA是否通过其他生物学过程影响AR仍需进一步研究。同时高通量测序技术的发展使得更多未知的lncRNA被发现并验证，这对我们从表观遗传学角度更好地揭示AR发病机制有很大帮助，也为AR的诊断及治疗提供新的思路。