当归精准煮散饮片指纹图谱建立及4种成分含量测定

俱蓉 ，杨秀娟 ，2，3，李响 ，王本欢 ，权起元 ，李硕 ，2，3，靳子明

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省高校中（藏）药化学与质量研究省级重点实验室，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省中药质量与标准研究重点实验室培育基地，甘肃 兰州 730000；4.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000

当归始载于《神农本草经》，列为中品，来源于伞形科植物当归（Oliv.）Diels.的干燥根，甘肃所产为“岷归”，为甘肃道地药材。现代研究表明，当归主要活性成分有挥发油（洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯等）、多糖（当归多糖等）、有机酸（绿原酸、阿魏酸等）等，具有调节机体免疫功能、抗菌、抗氧化等功能，对呼吸、血液、神经等系统有一定作用。

中药煮散是指原药材或饮片通过一定的加工方式，得到具有一定规格的粗颗粒，将其在水中煎煮而煎得的汤药。与传统汤剂比较，煮散的有效成分含量和干膏率均高于饮片，且中药煮散在节省药材、节约煎煮时间及增加煎出率等方面有明显优势。宋代庞安时《伤寒总病论》有“汤液之制，遭值天下祸乱之久，地脉薄产之时，天灾众多之世，安得不吝惜而为煮散乎”的描述，可见煮散目的是在资源稀缺时替代饮片使用、节省药材。但目前煮散“粗颗粒”的粒径确定尚无科学依据，且煎煮得到的汤剂易粘锅、有焦味，煮散的形态与传统饮片相比无法进行准确鉴别，且难以确定煮散与传统饮片的对应量效关系，亟需对煮散制备工艺及质量控制标准进行研究。精准煮散饮片可为煮散规范化生产及质量控制提供研究思路。当归精准煮散饮片是指将当归饮片通过一定加工方式制作成规格统一的粗颗粒。本课题组前期研究得到当归精准煮散饮片的最佳粒度为 0.400～0.475 cm。

中药指纹图谱技术现已广泛用于中药材质量控制。利用指纹图谱可从整体上评价当归药材质量，具有体现药材特异性和信息丰富性的作用。对当归精准煮散饮片进行指纹图谱研究，是对其内在质量的保证，也是对其关键化学信息的保存。本研究采用HPLC对10批当归精准煮散饮片进行指纹图谱研究，并测定绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ和藁本内酯的含量，将传统饮片与精准煮散饮片作对比，得到2种饮片“量”的对应关系，为当归精准煮散饮片的质量控制及其开发利用提供参考依据。

1 仪器与试药

CPA224D电子天平、BSA224S-CW十万之一电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；LC-20高效液相色谱仪、DAD检测器（日本岛津）；CH-300型粗碎机（江阴市高宏机械制造有限公司）；KQ500VDE超声波清洁器（昆山市超声仪器有限公司）。

阿魏酸对照品（批号 L03A9D57744，纯度≥98%），绿原酸对照品（批号Y22M8K365444，纯度≥98%），藁本内酯对照品（批号R06S10F97166，纯度≥98%），洋川芎内酯Ⅰ对照品（批号 A6A10F85918，纯度≥98%），上海源叶生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

当归饮片（甘肃陇西保和堂药业有限责任公司，批号 20191002、20191005、20191006、20191101、20191102、20191104、20191106、20191201、20191204、20191205，编号 S1～S10），经甘肃中医药大学李硕副教授鉴定为伞形科植物当归（Oliv.）Diels的干燥根。将当归饮片制备为煮散颗粒，备用。本品呈方形、菱形或类方形的不规则状粗颗粒，粒度为0.400～0.475 cm（4～5目），表面浅棕色至棕黄色，有的具有外表皮，香气浓郁，味甘、辛、微苦。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Robusta C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱程序见表1，检测波长280 nm，进样量20 μL，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃。

表1 流动相梯度洗脱程序（%）

2.2 对照品溶液制备

精密称取阿魏酸、绿原酸、洋川芎内酯Ⅰ和藁本内酯对照品适量，加甲醇制成浓度分别为 0.870 4、1.170 1、0.890 0、2.101 1 mg/mL的对照品溶液。分别吸取上述对照品溶液1.00 mL，定容至100 mL棕色容量瓶中，制成混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取当归精准煮散饮片1 g，精密称定，置锥形瓶中，加70%甲醇25 mL，称定质量，超声（功率250 W，频率40 kHz）提取40 min，取出，冷却至室温，再次称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，过滤，取续滤液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验

精密吸取供试品溶液20 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）计算，各指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.99，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的要求。

2.4.2 重复性试验

取同一批样品，按“2.3”项下方法平行制备 6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）计算，指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.99，表明此方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

取样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、24 h，按“2.1”项下色谱条件进样，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）计算，各指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.99，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5 指纹图谱建立

2.5.1 特征指纹峰标定

按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析 10批当归精准煮散饮片，指纹图谱见图1。将检测数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版），生成当归精准煮散饮片的对照指纹图谱及共有模式，手动标识mark峰并进行相关匹配，确定了 26个共有特征峰，其峰面积总和高于总峰面积的90%。将当归精准煮散饮片HPLC指纹图谱与传统饮片色谱图和混合对照品溶液色谱图进行比对，确定了4个共有成分，分别为绿原酸（5号峰）、阿魏酸（8号峰）、洋川芎内酯Ⅰ（12号峰）、藁本内酯（25号峰），见图2。

图1 10批当归精准煮散饮片HPLC指纹图谱

图2 当归精准煮散饮片HPLC指纹图谱特征峰标定

2.5.2 相似度评价

将HPLC指纹图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版），进行相似度分析，结果相似度均大于0.97，见表2。表明10批当归精准煮散饮片具有较好的相似性，本试验建立的指纹图谱方法体系合理有效。

表2 10批当归精准煮散饮片指纹图谱相似度评价（r）

2.6 含量测定

2.6.1 线性关系考察

精密吸取“2.2”项下藁本内酯对照品溶液1 mL，用甲醇定容至10 mL棕色容量瓶中。分别精密吸取一定量“2.2”项下绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ和稀释后的藁本内酯对照品溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，分别进样10、20、30、40、60、80 μL。以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，计算绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ和藁本内酯的回归方程，结果见表3，表明4种成分线性关系良好。

表3 4种成分线性关系考察结果

2.6.2 精密度试验

精密吸取“2.2”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，得到绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ和藁本内酯的峰面积 RSD分别为 0.92%、0.69%、1.03%、1.79%，表明仪器精密度良好。

2.6.3 重复性试验

取S1样品，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算含量，得到绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ和藁本内酯的平均含量分别为 0.473、0.783、0.244、12.331 mg/g，RSD分别为 1.79%、1.18%、1.19%、1.32%，表明该方法重复性良好。

2.6.4 稳定性试验

取S1样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、24 h，按“2.1”项下色谱条件进样，结果绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ和藁本内酯的峰面积RSD分别为2.07%、1.18%、1.35%、1.26%，表明供试品溶液在24 h内具有较好的稳定性。

2.6.5 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品6份，分别加入一定量的“2.2”项下对照品溶液，按“2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件测定，计算绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ和藁本内酯的加样回收率，结果见表4。

表4 4种成分加样回收率试验结果

2.6.6 样品含量测定

按“2.3”项下方法制备当归精准煮散饮片和传统饮片供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件测定，计算 10批当归精准煮散饮片和传统饮片中绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ和藁本内酯的含量，结果见表5。

表5 10批当归精准煮散饮片和传统饮片中4种成分含量测定结果（mg/g）

2.7 独立性权重法评分分析

独立性权重法数据之间相关性，使用回归分析得到复相关系数R，该值越大表明共线性越强，则权重越低。以 10批当归精准煮散饮片和传统饮片样品中绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ和藁本内酯含量为评价指标，进行加权评分，4种成分的权重见表6。将当归精准煮散饮片与传统饮片的4种成分均值与权重系数相乘得到的综合得分进行比较，得到1 g当归精准煮散饮片相当于传统饮片1.26 g，结果见表7。

表6 独立性权重法计算4种成分权重结果

表7 当归精准煮散饮片与传统饮片综合得分比较

3 讨论

本课题组在制备当归精准煮散饮片时，进行了不同粒度的比较，2020年版《中华人民共和国药典》规定的粉末等级（中粉、细粉、极细粉等）均在煎煮过程中出现了糊化、粘锅问题，且药液澄清度不高。考虑当归精准煮散饮片挥发油随粒度变小而容易流失，将当归精准煮散饮片最佳粒度确定为0.400～0.475 cm。精准煮散饮片质量控制的关键，是在确定最佳粒度的基础上评价其整体药效成分含量，故课题组进行色谱指纹图谱和代表化学成分含量测定的研究，以期获得粒度均一、质量稳定的精准煮散饮片。

本研究对色谱条件进行了考察，对乙腈-1%甲酸水、甲醇-水和乙腈-0.2%磷酸作为流动相的洗脱效果进行比较，运用DAD检测器进行全波长扫描，确定采用乙腈-0.2%磷酸为流动相梯度洗脱，检测波长为280 nm。将当归传统饮片与精准煮散饮片色谱图进行比对，确定共有成分，10批当归精准煮散饮片指纹图谱相似度均大于0.97，表明不同批次间相似度良好，指纹图谱可代表当归精准煮散饮片的整体信息。

本试验在比较CRITIC法、信息量权重法、熵权系数法、独立性权重法及加权评分法的基础上，采用独立性权重法作为综合评定方法，将每种成分进行单独加权，结果显示，当归精准煮散饮片1 g相当于传统饮片1.26 g，且当归传统饮片中这4种成分的含量整体低于当归精准煮散饮片。

本试验建立的指纹图谱与含量测定方法稳定可靠，可用于当归精准煮散饮片的质量控制与评价。当归精准煮散饮片与传统饮片HPLC指纹图谱的整体信息，可为其规范化生产及质量控制提供依据，也可为根及根茎类中药材煮散研究及临床应用提供参考。