青黛对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织TGF-β/Smad信号通路相关因子表达的影响

苑致维 ，张尔馨 ，郑沁薇 ，杨丹 ，吴悠 ，郝微微

1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437；2.上海市中医药研究院脾胃病研究所，上海 200032

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，主要累及结直肠黏膜及黏膜下层，主要临床表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便，是消化系统的常见病、多发病。目前有关UC的病因、发病机制尚不明确。一般认为肠道免疫功能紊乱是主要原因。相关流行病学调查显示，近年来 UC在亚洲国家患病率大幅增加。转化生长因子-β（TGF-β）是一种多效性细胞因子，具有明显的抗炎活性，活化的TGF-β与其受体结合，通过TGF-β/Smad信号通路调节黏膜免疫反应，促进组织修复，是治疗UC的关键靶标。上海市名中医马贵同教授认为，湿、热、瘀互结肠道为UC发病的关键，治以清热化湿、活血止血，并以青黛、三七等中药制成直肠给药制剂清肠栓。既往对清肠栓进行多次拆方研究发现，方中青黛对UC治疗起主要作用。课题组前期研究表明，青黛及其主要成分靛玉红能不同程度修复 UC小鼠结肠损伤，促进黏膜愈合。本实验在前期研究基础上，基于TGF-β/Smad信号通路进一步探讨青黛治疗UC的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠40只，6～8周龄，体质量（180±20）g，上海吉辉实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（沪）2017-0012。饲养于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院动物实验中心，温度21～25 ℃，相对湿度 40%～70%，进食标准饲料，通风环境。本研究经上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院动物伦理委员会审查批准（YYLAC-2020-080）。

1.2 药物及制备

青黛配方颗粒，购自上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院中药房，批号19052101。将3 g青黛配方颗粒溶于20 mL 0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液，配制成浓度为0.15 g/mL青黛混悬液。美沙拉嗪栓，黑龙江天宏药业股份有限公司，批号191203，取1 g美沙拉嗪栓溶于20 mL 0.5%CMC-Na溶液，配制成浓度为0.05 g/mL美沙拉嗪液。

1.3 主要试剂与仪器

葡聚糖硫酸钠（DSS），美国MP Bio公司，货号SR01636；BCA蛋白定量检测试剂盒，上海昕达生物科技有限公司，批号BL521A；组织裂解液、蛋白酶抑制剂、HE染色试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为P0013B、ZS018、C0105；化学发光试剂盒，美国 Thermo公司，批号 RJ238638；SDS-PAGE配胶试剂盒，上海雅酶生物科技有限公司，货号 PG111-7.5；TGF-β、Smad2/3、p-Smad2/3抗体，美国CST公司，货号分别为3711、8685、8828；粪便隐血试剂组，珠海贝索生物技术有限公司，批号BA-2020E；通用型RNA提取试剂盒、RT-PCR反转录试剂盒、SYBR-Green试剂盒，上海艾科瑞生物科技有限公司，批号分别为 AG21017、AG11706、AG11701。Synergy H4型多功能酶标仪（美国Bio Tek公司），TG16W微型离心机（北京天根生化科技有限公司），5417R型离心机（德国 Eppendorf公司），X85-2S恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司），HERA safe KS12型超净工作台（美国Thermo Fisher公司），IX71/BX53型显微镜（日本Olympus公司），垂直电泳仪、电泳槽、转膜仪（美国Bio Rad公司），TP1020自动脱水机（德国Leica公司），TEC-2601摊片机（上海精密仪器仪表有限公司），MX-S涡旋混匀仪（美国 Scilogex公司），EG1150H＋C石蜡包埋机（德国Leica公司），RM2235切片机（德国Leica公司）。

2 实验方法

2.1 分组与造模

按随机数字表法将40只大鼠分为正常组、模型组、青黛组、美沙拉嗪组，每组10只。适应性饲养1周，模型组、青黛组、美沙拉嗪组大鼠自由饮用5%DSS溶液7 d，制备UC大鼠模型，正常组饮用蒸馏水。

2.2 给药

造模结束后，青黛组和美沙拉嗪组分别予青黛混悬液（0.27 g/kg）、美沙拉嗪液（0.1 g/kg）灌肠（给药剂量按70 kg成人临床常用剂量与大鼠体表面积换算），给药体积 0.4 mL，正常组和模型组予等体积CMC-Na溶液灌肠，连续7 d。将大鼠置于固定器内，暴露肛门位置，一手固定其尾部，一手将采血软管轻轻旋转进入肠管（约7～8 cm），软管另一端连接注射器，缓慢推入相应药液，灌肠完毕拔出软管，用纱布及夹子夹住肛门，提起大鼠尾巴倒悬15 min，将大鼠放回笼内，自由活动15 min后取下夹子。

2.3 疾病活动指数评分

每日记录大鼠体质量变化，观察大鼠粪便性状改变，按试剂盒说明书检测粪便隐血情况，计算大鼠疾病活动指数。疾病活动指数＝（体质量评分＋粪便性状评分＋隐血评分）÷3。体质量评分标准：体质量无减轻计0分，体质量减轻≤5%计1分，5%＜体质量减轻≤10%计2分，10%＜体质量减轻≤15%计3分，体质量减轻＞15%计4分；粪便性状评分标准：正常计0分，松散便计2分，水样腹泻计4分；隐血评分标准：正常计0分，隐血计2分，肉眼血计4分。

2.4 取材

干预结束后，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，室温静置15 min，4 ℃、3 000/min离心15 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存备用。取回盲部至远端直肠区结肠，纵向剪开，预冷的生理盐水冲洗2次，洗净粪便，吸干水分，记录结肠长度。每只大鼠取1 cm结肠，放入10%多聚甲醛中固定，用于后续病理观察。其余结肠分装于冻存管，置于-80 ℃冰箱保存。

2.5 HE染色

大鼠结肠置于10%多聚甲醛中固定2 d，蒸馏水冲洗5 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片（厚度4 μm），常规HE染色，中性树胶封片，显微镜下观察结肠组织病理变化。

2.6 Western blot检测

取大鼠结肠，加入裂解液裂解，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，蛋白变性后，等量蛋白上样，经SDS-PAGE、转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入TGF-β（1∶1 000）、Smad2（1∶1 000）、Smad3（1∶1 000）和p-Smad2/3（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育过夜，加入相应二抗（1∶10 000），室温孵育2 h，采用GelDoc Go凝胶成像系统曝光显影，Image J图像分析软件分析目的蛋白灰度值。

2.7 RT-PCR检测

称取50 mg大鼠结肠，液氮中研磨成粉末，加适量裂解液，超低温匀浆器匀浆，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清液，RNA提取试剂盒提取总RNA，超微量分光光度计测定RNA浓度及纯度，按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。进行PCR，配制20 μL反应体系，按试剂盒说明书进行扩增，引物序列见表1，以β-actin为内参，采用2法分析mRNA相对表达量。

表1 各基因PCR引物序列

3 统计学方法

4 结果

4.1 青黛对模型大鼠疾病活动指数的影响

正常组大鼠反应灵敏、毛色光滑，体质量正常增长，粪便呈麦粒状；模型组大鼠反应迟钝、毛色黯淡、体形消瘦，粪质较软，出现肉眼血便，其中因便血严重、体质量下降明显死亡2只；青黛组、美沙拉嗪组大鼠上述表现均有不同程度改善，因便血严重、体质量下降明显各死亡1只。

与正常组比较，模型组大鼠疾病活动指数明显升高（＜0.01）；与模型组比较，青黛组、美沙拉嗪组大鼠疾病活动指数明显降低（＜0.05，＜0.01），见表2。青黛组、美沙拉嗪组肉眼血便转为无血便。

表2 各组大鼠疾病活动指数比较（±s）

4.2 青黛对模型大鼠结肠长度的影响

与正常组比较，模型组大鼠结肠长度明显缩短（＜0.01）；与模型组比较，美沙拉嗪组大鼠结肠长度明显增加（＜0.05），青黛组大鼠结肠长度无明显变化（＞0.05）。结果见表3。

表3 各组大鼠结肠长度比较（±s，cm）

4.3 青黛对模型大鼠结肠组织病理形态的影响

正常组大鼠结肠黏膜上皮完整，无充血及水肿，腺体结构完整，排列整齐，无溃疡形成，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠结肠黏膜上皮破损，伴充血水肿，腺体排列紊乱，部分坏死或消失，黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润，并有溃疡形成；青黛组及美沙拉嗪组大鼠结肠黏膜上皮损伤有所修复，腺体、杯状细胞增多，排列较整齐，炎性细胞明显减少。见图1。

图1 各组大鼠结肠组织形态（HE染色，标尺＝100 μm）

4.4 青黛对模型大鼠结肠组织转化生长因子-β、Smad2、Smad3、p-Smad2/3蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠结肠组织 TGF-β、p-Smad2/3蛋白表达明显降低（＜0.01）；与模型组比较，青黛组大鼠结肠组织TGF-β、Smad2、Smad3、p-Smad2/3蛋白表达明显升高（＜0.05），美沙拉嗪组大鼠结肠组织TGF-β、p-Smad2/3蛋白表达明显升高（＜0.05，＜0.01）。结果见表4、图2。

表4 各组大鼠结肠组织TGF-β、Smad2、Smad3和p-Smad2/3蛋白表达比较（±s）

图2 各组大鼠结肠组织TGF-β、Smad2、Smad3和p-Smad2/3蛋白免疫印迹

4.5 青黛对模型大鼠结肠组织转化生长因子-β、Smad2、Smad3、Snail mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠结肠组织 TGF-β、Smad3、Snail mRNA表达明显降低（＜0.05）；与模型组比较，青黛组大鼠结肠组织TGF-β、Smad3、Snail mRNA表达明显升高（＜0.05），美沙拉嗪组大鼠结肠组织TGF-β、Smad2、Smad3、Snail mRNA表达明显升高（＜0.05，＜0.01）。结果见表5。

表5 各组大鼠结肠组织TGF-β、Smad2、Smad3和Snail mRNA 表达比较（±s）

5 讨论

UC属中医学“痢疾”“肠澼”范畴。《素问•太阴阳明论篇》指出，“食饮不节，起居不时者，阴受之……阴受之则入五脏……入五脏则䐜满闭塞，下为飧泄，久为肠澼”。主要因外感湿热邪毒、情志失调、饮食不节等致湿热瘀滞大肠，气滞血瘀、脂膜血络受损。

青黛味咸，性寒，归肝、肺、胃经，有清热、凉血、解毒之功。《仙拈集》记载久疟饮治疗久疟：“青黛（澄去灰土）、雄黄（水飞）各等分。为末。每岁一分，空心及夜，淡醋汤下，块消其病即止。”现代研究表明，青黛具有抑制炎症反应、调节免疫、促进黏膜愈合等作用。本研究结果显示，正常组大鼠结肠黏膜上皮完整，无充血及水肿，腺体结构完整，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠结肠黏膜上皮破损，伴充血及水肿，腺体排列紊乱，黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润；青黛组和美沙拉嗪组大鼠结肠黏膜上皮损伤有不同程度修复，腺体增多，排列较为整齐，炎性细胞明显减少。表明青黛能有效抑制炎症反应，修复UC大鼠结肠损伤，促进黏膜愈合。

免疫功能障碍、易感基因及环境等综合作用是导致UC发病的最主要原因，机体分泌大量炎症介质与炎症细胞因子造成肠黏膜受损。UC发病时，肠黏膜通透性发生改变，肠腔内有害物质进入黏膜固有层，进而激活免疫细胞，诱导炎症反应发生。课题组前期研究发现，青黛可能通过调节 CD4CD25Treg细胞、CD4T细胞及Foxp3蛋白表达，发挥治疗UC的作用。TGF-β是由多种细胞产生的多效性细胞因子，包括免疫细胞、上皮细胞和成纤维细胞，其作为抑制免疫反应、细胞增殖和肿瘤发生的细胞因子，可调节多种细胞功能。TGF-β可抑制肠道炎症反应，有助于诱导免疫耐受，恢复受损的TGF-β信号通路被认为是治疗炎症性肠病的途径。在Smad依赖的经典途径中，p-Smad2和p-Smad3可形成二聚体后再与Smad4形成复合物，复合物可进入细胞核调节靶基因转录。研究显示，炎症性肠病肠内炎症特征由TGF-β信号传导受损、p-Smad2/3表达降低和Smad7（Smad3磷酸化抑制剂）表达升高引起。本实验结果显示，模型组大鼠结肠组织TGF-β、p-Smad2/3蛋白表达降低，青黛干预后，结肠组织TGF-β、Smad2、Smad3、p-Smad2/3 蛋白及 TGF-β、Smad3、Snail mRNA表达上调，提示青黛可能通过TGF-β/Smad信号通路抑制炎症反应，促进黏膜修复。

综上所述，青黛在抑制UC大鼠炎症反应和促进损伤修复两方面同时发挥作用，其作用机制可能与TGF-β/Smad信号通路有关。青黛如何调控TGF-β/Smad信号通路发挥治疗 UC的作用有待今后进一步研究。