IL-13、IL-4及FCERIB基因多态性对吸入糖皮质激素治疗儿童哮喘疗效的影响*

张炫炜，郦凡，姚建军

(绍兴第二医院儿科，浙江绍兴 312000)

哮喘是一种慢性呼吸道炎症性疾病, 多于儿童期发病。炎症与气道高反应性相关,若延误时机诊治,随病程迁移，患儿易发生不可逆性气道损伤[1-2]。目前临床上将吸入糖皮质激素(inhaled corticosteroids, ICS)作为哮喘治疗的长期药物, 多数患儿可从中获益,但也存在部分患儿经规范用药后病情仍反复,且肺功能呈渐进性下降,治疗效果存在个体差异[3]。此个体差异可能与患儿基因多态性有关。研究证实，IgE可反应机体炎症与过敏性反应水平,是诊断哮喘的生物学标志物之一[4]。免疫球蛋白E(mmunoglobulin E, IgE)主要通过FCER1B基因(又称为MS4A2基因)活化肥大细胞，从而引发即时超敏反应，参与过敏反应机制[5]。IL-13主要通过促进B细胞活化,对IgE合成调节及哮喘相关炎症的发生、发展具有重要作用[6]。IL-4基因可诱导B淋巴细胞合成IgE,在Ⅰ型变态反应中发挥重要作用[7]。本研究基于IL-13、IL-4及FCER1B基因多态性与IgE水平相关以及ICS治疗可以降低患儿血清总IgE水平,推测IL-13、IL-4及FCER1B基因多态性与患儿ICS治疗效果存在一定的相关性,并对此展开分析。

1 研究对象与方法

1.1研究对象 收集2020年1月至2022年1月绍兴市第二医院儿科救治的急性发作期哮喘患儿56例作为急性发作期组,其中男30例,女26例,年龄(8.24±1.35)岁；慢性持续期哮喘患儿52例作为慢性持续期组, 其中男28例,女24例,年龄(8.33±1.42)岁；临床缓解期哮喘患儿53例作为临床缓解期组,其中男27例,女26例,年龄(8.35±1.37)岁。纳入标准：符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》中哮喘诊断标准[8]；行ICS治疗；临床依从性好者。排除标准：先天性肺部疾病、先天性心脏病等患儿；异物吸入导致的喘息患儿；变态反应性支气管肺曲菌病、急慢性支气管炎、支气管淋巴结结核患儿。另选取同期体检健康者60例作为健康人对照组，其中男32例,女28例,年龄(8.29±1.38)岁。本研究经绍兴市第二医院医学伦理委员会批准(批准文号：2020L0121),患儿家属知情同意。

1.2主要仪器及试剂 DNA提取试剂盒(北京天根生化科技北京有限公司),IgE试剂盒(美国贝克曼库尔特公司)。UniCel Dxl 800免疫分析系统(美国贝克曼库尔特公司),UV1901PC分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司),ABI7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.3样本采集 将采样拭子伸进口腔, 紧靠脸颊内侧来回刮拭15次以上,并不时旋转拭子,使其充分接触口腔黏膜,最后将拭子头部折断后放入采集管,盖紧管盖,5 d内常温送检。

1.4DNA提取及荧光定量PCR反应 采用DNA提取试剂盒提取口腔脱落细胞样本的DNA,分光光度法测定吸光度(A260 nm/A280 nm)比值,取DNA纯度约为1.9,浓度为20 ng/μL的样本,置于4 ℃保存。根据GenBank中IL-13基因的序列号(NM_051345.1),IL-4基因序列号(NC_051345.1),FCER1B基因序列号(NC_000011.10),用Primer Premier 5.0软件设计引物,并送上海生工公司合成。引物序列见表1。PCR总反应体系为25 μL,包括10 μmol/L上、下游引物各1 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL,10×PCR buffer 2 μL,模板DNA 2 μL,Taq酶0.2 μL,无菌ddH2O补足体积。PCR循环参数:95 ℃预变性5 min；95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s,共45个循环；72 ℃ 5 min。于60 ℃时收集FAM与HEX荧光。采用ABI 7500荧光定量PCR仪进行检测及结果分析。根据3个基因的荧光曲线判读其基因型,由上海科医联创医学检验所完成多态性分析。

表1 引物序列

1.5血清IgE测定 取1.2中各组患者的血清标本10 μL,由本院检验科采用化学发光法测定治疗前后临床缓解期、慢性持续期、急性发作期哮喘患儿IgE水平差异,IgE参考区间：<100 IU/mL。

1.6ICS治疗及随访 依据指南标准及患儿情况,给予入组患儿ICS治疗(布地奈德200 μg,2次/天。治疗观察期为3个月,期间可根据病情按需吸入快速缓解药沙丁胺醇气雾剂),并进行常规疗效评估检测,包含肺功能[1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in one second, FEV1)、1秒用力呼气容积与最大肺活量比值(ratio of forced expiratory volume in one second to maximum vital capacity, FEV1/VCmax)、用力呼出50%肺活量时的平均呼气流速(average expiratory flow rate when forced expiratory 50% vital capacity, MEF50)]、呼出气一氧化氮(exhaled nitric oxide, Fe-NO)检测及儿童哮喘控制测试量表(Asthma Control Scale for Children, C-ACT)评分，并计算各指标的Δ值(治疗后的肺功能改善值减去治疗前的值得到的差值)。根据C-ACT评分结果将慢性持续期哮喘患儿及临床缓解期哮喘患儿分为控制组(25分)49例、部分控制组(20～24分)37例和未控制组(<20分)19例。

2 结果

2.1治疗前后各组哮喘患儿血清IgE水平变化 与治疗前相比, 临床缓解期、慢性持续期、急性发作期哮喘患儿在治疗后血清IgE水平均降低(335.42±37.34 IU/mL vs 158.71±28.38 IU/mL, 446.71±40.95 IU/mL vs 166.92±29.56 IU/mL, 681.52±96.57 IU/mL vs 435.17±62.15 IU/mL,t值分别为28.195,39.949,15.617,P均<0.05)。

2.2各研究对象基本资料与基因多态性分析结果 健康人对照组、临床缓解期、慢性持续期+急性发作期患儿IL-13、IL-4、FCERIB基因表达型差异均有统计学意义(P<0.05), 见表2～表4。

2.3哮喘患儿IL-13、IL-4及FCERIB基因各基因型肺功能比较结果IL-13基因rs20541位点GG型ΔFEV1、ΔFEV1/VCmax、ΔMEF50水平高于GA型与AA型(P<0.05),而ΔC-ACT水平GG型、GA型高于AA型(P<0.05)；IL-4基因rs2243250位点CC型ΔFEV1、ΔFEV1/VCmax、ΔMEF50、ΔFe-NO、ΔC-ACT水平高于CT型与TT型(P<0.05)；FCERIB基因rs569108位点AA型ΔFEV1、ΔFEV1/VCmax、ΔMEF50、ΔC-ACT水平高于AG型与GG型,见表5～表7。

2.4不同治疗效果哮喘患儿IL-13、IL-4及FCERIB基因多态性分布IL-13基因rs20541位点控制组AA型、A等位基因比例,IL-4基因rs2243250位点控制组T等位基因比例,FCERIB基因rs569108位点GG型、G等位基因比例均低于未控制组(χ2分别为4.902,19.781,7.451,5.127,11.977,P<0.05),见表8～10。

表8 IL-13基因rs20541位点多态性与临床疗效关系[n(%)]

表9 IL-4基因rs2243250多态性与临床疗效关系[n(%)]

表10 FCERIB基因rs569108多态性与临床疗效关系[n(%)]

3 讨论

哮喘是多在儿童期发病的气道非特异性炎性疾病,严重影响患儿生活质量甚至生存。ICS是治疗哮喘的有效方式,但是部分患儿无法从中获益,个体化差异的原因可能与基因多态性有关。哮喘患儿呈现气道高反应特性,血清高IgE水平与气道高反应性相关,IgE作为分泌性免疫球蛋白,是引发Ⅰ型变态反应的主要抗体,哮喘患儿较健康人血清中IgE的含量明显升高[9]。因此，检测血清IgE水平对评估患儿病情以及治疗反应性有较大帮助,有利于哮喘的防治。本研究中不同哮喘分期患儿血清IgE水平差异显著,急性发作期、慢性持续期、临床缓解期患儿血清IgE水平呈下降趋势,且经ICS治疗后, 患儿IgE水平下降,提示IgE水平与患儿疗效相关,与李云等[10]的研究结果基本一致。

总IgE水平很大程度上取决于遗传因素,有研究显示，FCER1B-109C/T启动子多态性是影响血清总IgE的因素[11]。Oh等[12]研究显示,韩国哮喘儿童血清IgE水平与FCER1B654C/T多态性有关；de Guia等[13]研究显示,反应性鼻炎患儿FCER1Brs569108的基因位点多态性与血清IgE水平呈高度相关性。张平波等[14]研究显示,FCER1Brs569108位点基因多态性与哮喘预测指数及特应性相关。但FCER1Brs569108位点基因多态性是否与患儿ICS治疗效果有关尚缺乏证据。本研究显示，哮喘患儿FCER1Brs569108 A/G突变率显著高于健康人对照组,与张平波等[14]研究结果类似,哮喘患儿FCER1Brs569108位点存在AA型、AG型、GG型,进一步通过随访发现患儿经ICS治疗后取得良好效果,肺功能有效提高,Fe-NO下降,C-ACT评分上升。但各基因型治疗效果存在差异,AA型患儿对ICS治疗反应性更好,AG型次之,GG型更差,控制组AA型所占比例更高,提示位点A/G突变会降低患儿对ICS的治疗效果,此基因型患儿应选取其他治疗方案。

IL-4和IL-13基因多态性也可显著影响血清中的IgE水平,从而使得哮喘的发病危险性升高[15]。IL-13主要通过促进B细胞活化,对IgE合成调节以及哮喘相关炎症的发生、发展具有重要作用。IL-4可诱导B淋巴细胞合成IgE,在Ⅰ型变态反应中发挥重要作用。有研究表明,IL-13rs20541位点的变异与血清IgE总水平升高及哮喘有关[16],龙易勤等[17]的一项研究显示，携带IL-4基因rs2243250野生型AA位点的哮喘病患儿体内表达的IgE水平远高于对照儿童。本研究中IL-4rs2243250、IL-13rs20541位点基因多态性与患儿的发病以及ICS治疗效果相关,治疗前各基因型患儿肺功能、Fe-NO水平、C-ACT评分差异无统计学意义,但IL-4rs2243250 CC型、IL-13rs20541 GG型对ICS治疗效果更好,肺功能改善情况、Fe-NO下降情况,C-ACT评分升高水平均高于各自的其他基因型,控制组患儿中IL-4rs2243250 CC型、IL-13rs20541 GG型比例更高。提示IL-4rs2243250位点C/T突变、IL-13rs20541 G/A突变会降低患儿ICS的治疗效果,患儿需考虑更换治疗方案,提高疗效,改善哮喘发作症状。

综上所述,FCER1Brs569108、IL-4rs2243250、IL-13rs20541基因多态性与哮喘患儿ICS疗效相关,该3个基因位点突变可能有助于预测哮喘患儿的ICS治疗效果,据此提供适合的个体化治疗方案,改善患儿的生存治疗。本研究也存在一定不足之处,如未进行FCER1B与IL-4、IL-13基因之间的相互机制研究等，今后仍需进一步分析。