非小细胞肺癌患者血清细胞外囊泡let-7d-3p水平检测的临床价值*

周雨潇，王成，王静，张钰，张春妮，汪俊军

(南京大学医学院附属金陵医院检验科，南京210002)

非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)发病率和死亡率均居恶性肿瘤前列，早期症状缺乏特异性，其诊断主要依赖于影像学方法，临床上缺乏有价值的血清学分子标志物，患者预后极差，5年生存期不足15%[1-2]。细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是一类由细胞主动分泌或释放至胞外的膜性小泡，广泛存在于包括外周血、尿液、乳汁等体液和细胞培液中，内含核酸、蛋白质、脂质等多种生物活性分子，具备作为多种疾病特别是肿瘤新型液体活检分子标志物的潜能[3-4]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是EVs中含量最为丰富的一类非编码小核酸分子，可来源于肿瘤细胞或病变组织分泌，并参与肿瘤微环境间细胞通讯、代谢调控、血管新生和肿瘤生长等病理过程，有望在恶性肿瘤的早期筛查中发挥重要作用[5]。报道显示，let-7家族 miRNA在不同物种中十分保守，且肿瘤组织中let-7家族miRNA常呈现出降低趋势并发挥抑癌作用，与恶性肿瘤特别是NSCLC的发生、发展密切相关[6]。目前，let-7家族 miRNA中关于let-7d(包括let-7d-3p和let-7d-5p)价值的研究报道较少，且大部分集中于let-7d-5p，外周血特别是EVs中let-7d-3p与NSCLC研究在国内尚未见报道；同时，与家族其他成员相比，不同肿瘤中let-7d-3p的变化趋势及生物学功能并不一致。为此，本研究针对NSCLC密切相关的let-7家族成员let-7d-3p，比较并分析NSCLC患者与健康人对照EVs中let-7d-3p的表达水平差异及其临床应用价值，探讨其作为NSCLC非侵入性液体活检分子标志物潜能。

1 资料与方法

1.1研究对象 选取2020年9月至2021年5月在南京大学医学院附属金陵医院(东部战区总医院)心胸外科收治并经病理组织学确诊的NSCLC患者102例，其中女性54例，男性48例，年龄(59.3±12.9)岁。病理类型为腺癌84例，鳞癌16例，未知2例；TNM分期：Ⅰ期65例，Ⅱ期4例，Ⅲ期6例，Ⅳ期21例，未知6例。NSCLC纳入标准：患者均符合国际肺癌研究学会(IASLC)第8版肺癌TNM分期中筛查标准[7]，且经病理组织学检查确诊；肝肾功能正常；凝血功能正常；初诊或初次患者。排除标准：存在肺部手术史；既往接受靶向治疗或放化疗治疗；合并其他恶性肿瘤；存在血液系统疾病。选取同期在本院健康体检中心体检各项指标正常的健康人70例为健康人对照组，其中女性34例，男性36例，年龄(56.8±6.3)岁。NSCLC患者组与健康人对照组间性别(Z=0.563 2，P=0.573 3)、年龄(t=1.501，P=0.135 2)之间的差异无统计学意义。本研究经东部战区总医院医学伦理委员会批准(批准文号：2020DZGZRZX-022)，各研究对象知情同意。

1.2仪器及试剂 5418型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，高速低温组织研磨仪(武汉塞维尔生物科技有限公司)，TL988-Ⅳ 96实时荧光定量PCR仪(西安天隆科技有限公司)，DW-86L626医用低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司)。Exosome 提取试剂盒、Trizol试剂(美国 Life Technologies 公司)，酸性水饱和酚(北京索莱宝公司)，分析纯级别氯仿、异丙醇、无水乙醇(上海国药集团试剂公司)，人工合成的let-7d-3p成熟体(广州锐博生物技术有限公司)，miRNA逆转录引物、qRT-PCR引物序列及TaqMan探针(美国Life Technologies公司)，逆转录体系和qRT-PCR体系所用试剂(大连TaKaRa公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集 用含分离胶的促凝真空采血管收集患者治疗前及健康人对照禁食12 h以上的静脉血3～5 mL，血液标本采集后迅速在室温下3 500×g离心10 min，用Eppendorf(EP)管收集上层血清，置于-80 ℃保存。

1.3.2血清EVs分离及RNA提取

1.3.2.1血清EVs分离 将血清标本从-80 ℃取出，置于室温温育，室温下2 000×g离心30 min。用全新无菌无DNA/RNA酶EP管(2 mL)收集上层血清100 μL。严格按照 EVs分离试剂盒说明书操作，按标本∶试剂比为5∶1(即100 μL血清加入20 μL试剂)的比例将标本和试剂充分涡旋混匀，再将二者混合物置于4 ℃冷沉淀30 min。沉淀完毕后于室温下10 000×g离心10 min。离心后尽量吸弃上层血清，仅保留管底的EVs沉淀。

1.3.2.2血清EVs RNA提取 用Trizol法提取血清EVs RNA，步骤：在提取EVs沉淀后，将2颗磁珠放入装有EVs沉淀的2 mL EP管中，加入1 mL Trizol 试剂，使用高速低温组织研磨仪以60 hz/min速度研磨EVs沉淀120 s，室温静置10 min。加入200 μL三氯甲烷，立即剧烈震荡直至混匀，室温静置10 min。4 ℃、16 000×g离心20 min，吸取上清液500 μL于新的1.5 mL无菌除酶EP 管内，与等体积异丙醇充分混合，-20 ℃沉淀1 h。4 ℃、16 000×g离心20 min。离心后弃去上清液，用75%乙醇溶液(DEPC水稀释)洗涤，再次4 ℃、16 000×g离心20 min。弃去上清液，将EP管倒扣至吸水纸上，自然晾干，加入20 μL DEPC水完全溶解RNA 沉淀，置于-80 ℃保存或立即进行下一步试验。

1.3.3实时荧光定量PCR检测EVs miRNA 用基于TaqMan探针的qRT-PCR法检测血清EVs中miRNA let-7d-3p(CUAUACGACCUGCUGCCUUUCU)

的表达水平。逆转录反应体系为10 μL，包括DEPC水3.5 μL，5×AMV缓冲液2.0 μL，10 mmol/L dNTP mixture 1.0 μL，逆转录引物1.0 μL，AMV逆转录酶(5 U/μL)0.5 μL，RNA样本2.0 μL。反应条件：16 ℃ 30 min；42 ℃ 30 min；85 ℃ 5 min。cDNA样本冻存于-20 ℃。qRT-PCR反应体系为20 μL，包括ddH2O 13.77 μL，10×PCR缓冲液2.0 μL，25 mmol/L MgCl21.2 μL，10 mmol/L dNTP mixture 0.4 μL，rTaq聚合酶(5 U/μL)0.3 μL，miRNA检测探针及引物混合物0.33 μL，cDNA 2.0 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。每个Ct值为相应样本重复测定3次后所得均值，同时以不含RNA的模板的ddH2O水作为阴性对照。

1.3.4标准曲线绘制 用基于TaqMan探针的qRT-PCR方法检测梯度稀释的人工合成let-7d-3成熟体。成熟体粉末按说明书进行溶解和稀释，步骤：1 nmol成熟体粉末离心后加入1 mL DEPC水配制成浓度1 μmol/L的母液，取10 μL母液加入990 μL DEPC水配成浓度为10-3μmol/L的RNA溶液，进行逆转录反应。倍比稀释：取1 μL逆转录后cDNA加入9 μL DEPC水配成10-4溶液，从10-4溶液中取1 μL加入9 μL DEPC水配成10-5溶液，从10-5溶液中取1 μL加入9 μL DEPC水配成10-6溶液，从10-6溶液中取1 μL加入9 μL DEPC水配成10-7溶液，从10-7溶液中取1 μL加入9 μL DEPC水配成10-8溶液，得到5个梯度稀释液后进行qRT-PCR。逆转录过程及qRT-PCR总反应体系和扩增条件与let-7d-3p检测一致并同步进行。最后，以成熟体浓度的对数值为纵坐标，以测得的Ct值为横坐标绘制标准曲线并计算样本EVs let-7d-3p的含量。

1.4数据统计和分析 采用GraphPad Prism 8.0和SPSS 25.0软件对数据进行统计学分析，其中正态分布资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本的t检验；非正态分布计量资料采用中位数(第25百分位数，第75百分位数)[M(P25，P75)]表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验，3组及3组以上比较采用Kruskal-WallisH检验。miRNA水平与变量间相关性分析采用Spearman相关分析。采用ROC曲线分析let-7d-3p表达水平对NSCLC患者的辅助筛查价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1血清EVs中let-7d-3p的表达水平 qRT-PCR结果显示，与健康人对照组[69.75 (25.64, 154.70)fmol/L]相比，NSCLC患者血清EVs中let-7d-3p的表达水平[26.09 (13.74, 45.56) fmol/L]明显降低，差异有统计学意义(U=1 830,P<0.001)。

2.2不同临床分期NSCLC患者血清EVs中let-7d-3p的表达水平 对患者按国际肺癌研究学会(IASLC)第8版肺癌TNM分期标准进行分期。与健康人对照组血清EVs let-7d-3p水平相比，NSCLC 临床Ⅰ期、Ⅲ期及Ⅳ期患者水平均降低，差异有统计学意义(P均<0.001)。NSCLC 临床Ⅱ期患者与健康人对照组相比，血清EVs let-7d-3p水平呈现降低趋势，但差异无统计学意义，且不同分期患者间let-7d-3p水平差异亦无统计学意义，见表1。

表1 不同临床分期NSCLC患者血清EVs let-7d-3p 表达水平比较

2.3NSCLC患者血清EVs中let-7d-3p的筛查效能分析 运用ROC曲线分析血清EVs中let-7d-3p水平区分NSCLC患者及早期(临床Ⅰ期)患者的临床效能，结果显示以健康人作为对照组，EVs中let-7d-3p区分NSCLC患者的ROC曲线下面积(the area under the ROC curve，AUCROC)为0.744(95%CI：0.667～0.821)，当cut-off值为45.07 fmol/L时，其筛查NSCLC的敏感性和特异性分别为74.5%和60%；同时，以健康人作为对照组，EVs中let-7d-3p区分NSCLC Ⅰ期患者的AUCROC为0.736(95%CI：0.653～0.819)，且当cut-off值为45.07 fmol/L时，其筛查NSCLC Ⅰ期患者的敏感性和特异性分别为75.4%和60%。

2.4不同临床因素对血清EVs中let-7d-3p的水平影响分析 对患者不同年龄(≥ 60岁 vs <60岁)、性别(男性vs女性)、吸烟史(有vs无)及病理类型(腺癌vs 鳞癌)组别间血清EVs中let-7d-3p的水平差异进行分析，结果显示不同年龄、性别、是否存在吸烟史和病理类型组别间let-7d-3p的水平差异均无统计学意义(U值分别为1 160,1 137，976和658，P值分别为0.349，0.287，0.489和0.898)，见表2。

表2 不同临床因素对NSCLC患者血清EVs let-7d-3p 表达水平的影响

3 讨论

目前临床上缺乏有价值的NSCLC血清学标志物，早期筛查困难。本研究针对NSCLC患者血清EVs中let-7d-3p的表达变化及价值开展研究，发现NSCLC患者特别是早期(临床Ⅰ期)患者血清EVs中let-7d-3p水平与健康人对照相比显著降低，具备作为NSCLC辅助筛查液体活检分子标志物潜能；同时，ROC曲线结果表明，EVs中let-7d-3p水平测定还可作为NSCLC早期辅助筛查分子标志物。

本研究发现NSCLC患者血清EVs中let-7d-3p的水平呈现明显降低趋势，与既往报道的let-7d-3p在肿瘤发生、发展中变化及发挥抑癌miRNA作用较为一致。Goldstraw 等[7]发现，上皮性卵巢癌患者血清let-7d-3p的水平显著降低，具备作为卵巢癌潜在的标志物。Nascimento等[8]发现宫颈癌患者血清let-7d-3p的水平也显著降低，具备作为宫颈癌新的分子标志物。但let-7d-3p在组织中变化与外周血中并不完全一致[9]。García-Vázquez等[10]发现，卵巢癌组织中let-7d-3p的表达水平与癌旁组织相比呈现显著升高趋势，且患者肿瘤组织中let-7d-3p水平与卡铂/紫杉醇化疗疗效呈显著正相关。Turashvili等[11]发现let-7d-3p在三阴乳腺癌患者中也呈现高表达，且高表达let-7d-3p与患者总生存率和无复发生存率明显相关，表明let-7d-3p可能与肿瘤患者疗效及预后密切相关，且外周血let-7d-3p的表达变化与有组织中呈现出不同特征，EVs则可能是外周血和组织变化不一致的潜在原因。

本研究结果显示，let-7d-3p在NSCLC患者血清EVs中的表达显著降低，但在不同吸烟史、鳞癌和腺癌患者间的表达未见明显差异。目前，关于let-7d-3p在肺癌中的变化报道较为有限。Li等[12]研究发现，let-7d-3p在NNK诱导的肺癌模型小鼠和NNK刺激的小鼠肺上皮细胞中的表达显著降低，且甘草查尔酮A治疗可逆转由NNK诱导的变化，提示let-7d-3p参与了NNK诱导的肺癌发生过程，并具备作为肺癌治疗潜在的靶点。Zhang等[13]通过生物信息学分析法和公共数据库分析发现let-7d-3p在肺癌患者中的表达升高，且let-7d-3p水平高表达的肺鳞癌患者预后更差。本研究与上述研究不一致的原因既可能是因为外周血和组织/细胞样本类型差异引起，也可能是本研究纳入的NSCLC鳞癌患者较少导致，后续应扩大样本量，深入验证癌组织和外周血以及肺腺癌和肺鳞癌患者EVs let-7d-3p的表达特征及差异。

本研究发现，let-7d-3p在早期NSCLC患者血清中即呈现显著降低，具备作为NSCLC早期辅助筛查标志物潜能。目前，关于EVs中let-7d-3p的研究才刚起步，肿瘤患者EVs中let-7d-3p的表达及价值研究仅见1篇报道。例如Zheng等[14]发现，宫颈癌患者血浆外泌体(Evs的一种亚类)中let-7d-3p的表达与对照相比显著降低，具备作为宫颈癌患者非侵入性液体活检分子标志物潜能。因此，后续应继续扩大肿瘤样本类型及数量，进一步探讨EVs let-7d-3p在其他肿瘤中的变化。

本研究存在一定的局限性。首先，本研究所纳入的样本量仍较少，样本来源也较为单一，后续应继续扩大样本量，从多中心角度深入探讨其对于NSCLC患者价值；其次，本研究未比较肺部良性疾病如良性结节、肺部炎症患者血清EVs中let-7d-3p水平，其对于NSCLC的筛查及鉴别诊断价值仍有待进一步研究；最后， let-7d-3p在NSCLC组织、细胞系及细胞培液中是否与血清EVs存在一致的变化尚不清楚， EVs let-7d-3p参与NSCLC的功能亦需在后续研究阐释。

综上所述，本研究针对let-7d-3p这一研究较少的miRNA，从血清EVs角度探讨了NSCLC患者血清EVs中let-7d-3p的变化及价值，发现NSCLC患者与健康人对照相比，患者血清EVs中let-7d-3p水平显著降低，且NSCLC Ⅰ期患者血清EVs中let-7d-3p水平亦显著降低，具备作为NSCLC患者辅助筛查液体活检分子标志物潜能。