基于电子鼻、GC-MS结合化学计量学方法鉴别烤羊肉掺假

王永瑞，柏 霜，罗瑞明，王松磊

（1.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏 银川 750021）

羊肉因其独特的风味以及蛋白质、氨基酸和钙、钾等物质含量高，脂肪和胆固醇含量低而倍受消费者的青睐[1]。但是，鉴于羊肉的价格高居不下，某些个人或企业为了牟取暴利将羊肉脂肪部分与鸡肉、鸭肉、猪肉、貂肉、老鼠肉等混合或仅添加羊肉香精处理后冒充羊肉进行销售[2]。近年来，全国各地假羊肉事件屡屡发生，如2009年无锡假羊肉事件[3]、2013年临邑与辽宁假羊肉事件[4-5]、 2017年大连假羊肉事件等[6]。因此，假羊肉准确快速的鉴别对稳定市场秩序、维护消费者权益极其重要。

羊肉最早的鉴别方式为感官评价，随着科学技术的革新，羊肉（制品）的鉴别方法已经发展到仪器分析法。如以蛋白质分析为主的电泳分析法、免疫分析法及色谱分析法等，以核酸分析为主的聚合酶链式反应法[7-10]、 环介导等温扩增技术、DNA分子杂交技术、重组酶聚合酶扩增技术等[11]，以波谱学为主的色谱分析法[12-14]、质谱检测法、近红外光谱法[15-18]，还有以化学传感器为主的电子鼻与电子舌法[19-22]的鉴别技术已被广泛研究应用。电子鼻具有操作简单、快速等优势，可以对样品一类物质的差异进行有效区分，但无法准确定量样品中各具体挥发性化合物[23-24]。而气相色谱-质谱具有准确定性、定量的特点，与电子鼻结合可极大发挥仪器的优势[25]， 可广泛应用于肉品掺假检测等方面。Hansen等[26]采用电子鼻结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术对肉类加工中的原材料进行了鉴别。Nurjuliana等[27]采用GC-MS法对原料肉和香肠是否掺入猪肉进行了鉴定。徐春晖等[28]采用GC-MS结合化学计量法鉴别出3种江西名茶中的20种特征挥发性成分，这为电子鼻、GC-MS结合化学计量法检测不同掺假羊肉样品特征差异挥发性成分提供了支持。

鸭肉的价格便宜，并且烤制后在色泽上以及口感上都与羊肉相似，因而是最常用于烤羊肉中掺假销售。本实验以烤羊肉掺假烤鸭肉为研究对象，采用电子鼻结合GC-MS对掺假不同比例烤鸭肉的烤羊肉样品进行定性、定量分析，通过主成分分析（principal component analysis，PCA）对肉品挥发性成分的电子鼻传感器响应进行区分，建立偏最小二乘判别模型筛选不同掺假比例烤羊肉样品中差异挥发性化合物，以期为烤羊肉掺假进行鉴定以及定量分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊肉为9 月龄体质量（30±1）kg的盐池公羊后腿，由宁夏鑫海食品有限公司提供；优质鸭腿肉 市购；1,2-二 氯苯、正构烷烃（C6～C26）（均为分析纯） 美国 Sigma-Aldrich公司；甲醇（色谱纯） 赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Qp2010ultra型GC-MS联用仪 日本Shimadzu公司；PK157330-U型手动固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司；DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；PEN 3.5 电子鼻 德国Airsence公司；WNB22型精密数显恒温水浴槽 上海树立仪器仪表有限公司；LT202E型电子 天平 常熟市天量仪器有限责任公司；XW-80A旋涡混合仪 上海嘉鹏科技有限公司；HQ-405型电烤箱 青岛汉尚电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 烤羊肉掺假鸭肉样品的制备

将羊骨头、鸭骨头分别从羊腿、鸭腿上去除，然后用自来水清洗羊肉、鸭肉，将表面的血迹和其他杂质洗净[29]。洗净后，将羊肉、鸭肉分别切成1.5 cm×1.5 cm×1.0 cm的小块，并分别置于上下面火都为250 ℃的电烤箱中，烤制12 min。取烤制成熟后的羊肉、鸭肉切碎成肉末，按照0%、25%、50%、75%、100%比例将烤鸭肉肉末掺入烤羊肉肉末中制成烤羊肉掺假样品，再进行涡旋使其充分混匀。

1.3.2 电子鼻检测

准确称取2.00 g样品于50 mL电子鼻进样瓶内，用聚四氟乙烯隔膜将瓶口密封。置于50 ℃水浴锅内保温30 min，然后放置室温平衡30 min。所有样品在12 h内完成检测，以最大程度降低样品之间的其他差异。每个样品平行3 次。设置电子鼻实验参数：样品准备5 s；检测时间100 s；测量计数1 s；自动调零时间10 s；清洗时间300 s；内部流量400 mL/min；进样流量400 mL/min。

1.3.3 掺假样品挥发性成分的顶空SPME萃取以及GC-MS分析

1.3.3.1 1,2-二氯苯内标液的配制

称取0.064 2 g的1,2-二氯苯，用甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶，配制成642 μg/mL的1,2-二氯苯-甲醇溶液母液并进行摇匀。取1 mL母液用甲醇稀释至100 mL容量瓶内并摇匀，配制成6.42 μg/mL的1,2-二氯苯-甲醇溶液作为内标物溶液进行后续分析。

1.3.3.2 风味物质的萃取

在使用萃取头萃取挥发性物质之前，先将50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头进行老化[30]。分别称取烤羊肉掺假样品（2±0.01）g置于15 mL顶空瓶中，向每个样品中加入用作内标的1,2-二氯苯（4 μL，6.42 μg/mL），使用涡旋仪混匀后用聚四氟乙烯隔膜将顶空瓶口密封。将其置于55 ℃水浴中20 min。然后将老化后的萃取头插入密封的萃取瓶中进行吸附，保持30 min，然后立即将其转移到GC进样口250 ℃解吸5 min。

1.3.3.3 GC-MS条件

GC条件：DB-WAX毛细管色谱柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：起始温度40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min升温到90 ℃，再以8 ℃/min升温到230 ℃保持10 min，载气为He，恒定流速1.8 mL/min，进样口温度250 ℃。

MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围m/z20～350；扫描方式为全扫描；溶剂延迟时间3 min。

1.3.3.4 定性与定量分析

挥发性物质经色谱柱分离后，化合物由质谱数据库NIST对比鉴定。根据已知质量浓度的1,2-二氯苯的峰面积，按式（1）计算烤羊肉掺假样品中各挥发性物质的含量：

式中：Ax和Ai分别为目标化合物的峰面积和内标化合物的峰面积；Ci为内标化合物的质量浓度/（μg/mL）；4为加入标准品体积/μL；2为加入样品质量/g；Mx为目标化合物的含量/（μg/kg）。

1.3.4 风味物质的评价

浓度以及感觉阈值共同决定了挥发性物质对于样品总体气味的贡献大小，因而本实验采用相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）法[31]对烤羊肉掺假样品中挥发性物质的香气贡献进行分析。ROAV按 式（2）计算：

式中：Mx和Ti分别为各挥发性物质的相对含量/%和感觉阈值/（μg/kg）；Mmax和Tmax分别为对总体气味贡献最大的挥发性物质的相对含量/%和感觉阈值/（μg/kg）。

1.4 数据处理

利用Excel对数据进行平均值和标准偏差分析；使用SPSS软件进行数据显著性差异分析，P＜0.01，差异极显著；电子鼻PCA图及GC-MS数据偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）图由SIMCA软件制作，热图由R语言制作。其他图使用Origin 18C软件制作。

2 结果与分析

2.1 电子鼻数据分析

2.1.1 电子鼻传感器响应信号分析

PEN3.5电子鼻内部含有10个金属传感器，当电子鼻传感器的响应曲线向上或向下偏离1时，则表明有挥发性化合物被检出。若传感器响应曲线在1附近趋于平稳则表示没有挥发性化合物被检出。50%掺假烤羊肉样品的电子鼻传感器响应曲线，如图1所示。电子鼻的10个传感器在进样后开始响应并且响应值逐渐偏离基线，然后逐渐趋于平稳，多数传感器在85 s后达到稳定状态，因而选取88～90 s这3 s的平均响应值作为特征值。肉样最高响应值达到5以上，说明肉样的挥发性成分浓度较高。其他传感器响应变化值差别不大，而W5S、W1W、W1S、W2W和W2S急剧增加，这表明掺假肉样中的含硫化合物、氮氧化合物以及部分芳香族化合物的含量较高。醛类和醇类是样品整体风味的主要贡献者。含硫含氮含氧等杂环化合物对烤制肉品的风味具有重要贡献，一般呈现烤肉香气特征。这些杂环类化合物主要与蛋白质和碳水化合物因高温而发生美拉德反应、Strecker降解反应、焦糖化反应和热解反应等有关[32]。这些物质的变化可能导致掺假样品W5S、W1W、W1S、W2W和W2S传感器检测到的响应值急剧增加，由此说明电子鼻能较好反映掺假肉样的总体挥发性成分信息。

图1 电子鼻对烤羊肉掺假的响应Fig. 1 Electronic nose sensor responses to volatile components of roast mutton adulterated with duck meat

如图2所示，不同比例掺假烤羊肉的雷达响应图存在明显差异，表明这5个样品能通过电子鼻进行区分。不同烤鸭肉比例的掺假烤羊肉样品的W5C、W6S、W3C、W1C和W3S的响应值几乎无变化，说明烷烃类化合物、氨类化合物以及大部分芳香族化合物含量较低且变化较小。其中由脂质氧化产生的氢过氧化物气味是导致W6S气味轮廓曲线差异的原因，这表明烤羊肉掺假样品中没有氢过氧化物或者特别少[33]。W5S传感器对氮氧化合物敏感，纯烤羊肉样品对该传感器响应值最高，25%鸭肉掺假、50%鸭肉掺假、75%鸭肉掺假逐渐降低，纯烤鸭肉的响应值最低，表明烤羊肉样品中的杂环类化合物的含量高于烤鸭肉样品。而W2S传感器则显示相反的变化趋势，表明烤鸭肉中醇类化合物含量高于烤羊肉样品。W1W和W2W均对硫化物敏感，而不同烤羊肉掺假样品的传感器响应值变化不显著。W1S的变化也表明烤鸭肉中醇类化合物含量高于烤羊肉样品。

图2 电子鼻对烤羊肉掺假烤鸭肉响应雷达图Fig. 2 Radar chart of electronic nose sensor responses to roast mutton adulterated with duck

2.1.2 电子鼻数据PCA

PCA是将研究对象的复杂多指标问题通过特定方式的数据转换，转化为简单且较少数量综合指标的一种重要统计方法，这些综合指标之间既互不相关又能最大化提供研究对象原有指标所反映的绝大部分信息，并能快速实现模式或关系的可视化识别[34]。利用SIMCA 14.0软件对掺假烤羊肉挥发性物质的含量进行PCA。在PCA中，R2X表示模型在X轴方向的解释率（即在X轴方向保留原始数据信息百分比的平方），R2X的值越接近于1，则保留原始数据信息就越多；Q2值代表模型的可预测能力，Q2值大于0.5时表明该模型的预测能力良好。本实验烤羊肉掺假样品PCA模型R2X为0.986，Q2为0.849，表明建立的模型可靠。

从图3a可以看出，5个烤羊肉掺假样品分布在PC空间中5个相对独立的区域，得到了明显区分，说明这5个样品挥发性成分的种类和相对含量存在差异。图3b可反映引起5个样品差异的关键变量，其中W1C、W3C、W3S传感器与纯烤羊肉相关联，W5S、W6S传感器与75%烤羊肉样品相关联，W1W、W2W传感器与50%烤羊肉相关联，W5C传感器与25%烤羊肉相关联，W1S，W2S传感器与纯烤鸭肉相关联。

图3 烤羊肉掺假样品PCA二维得分图（a）和二维载荷图（b）Fig. 3 PCA score plot (a) and loading plot (b) of roast mutton adulterated with duck

2.2 SPME-GC-MS检测结果分析

2.2.1 样品挥发性化合物种类和含量分析

基于电子鼻数据对于烤羊肉掺假样品挥发性物质的区分，进一步采用顶空-SPME结合GC-MS对烤羊肉掺假样品进行挥发性风味物质萃取，进行定量分析。在不同比例烤鸭肉掺假的烤羊肉样品中共检测出53种挥发性成分，其中检测出醇类12种、醛类15种、酸类3种、酯类2种、酮类8种、烷烃类8种、杂环类1种、其他物质4种。由图4可知，苯乙烯、6-甲基-十三烷、2,5二甲基十三烷、癸烷、乙酸己酯、4-甲基壬酸、丙酸、1-己醇、4-壬醇等物质在含烤鸭肉比例高的样品中含量较高，而大部分醛类和醇类物质在含烤羊肉比例高的样品中含量较高。纯烤羊肉中杂环类化合物如2-戊基呋喃的含量明显高于其他样品，这与电子鼻W5S传感器的结果一致。

图4 5个烤羊肉掺假样品挥发性化合物聚类热图Fig. 4 Clustering heat map of volatile compounds in five adulterated roast mutton samples

由图5A可知，在纯烤羊肉样品中，醛类物质、酮类物质、酸类物质以及杂环类物质的总含量明显高于纯烤鸭肉样品。其他类别挥发性化合物总含量差异不明显。而纯烤鸭肉样品中醇类物质的含量明显高于纯烤羊肉样品。这一结果与电子鼻的结果相对应，纯烤鸭肉样品对W2S传感器响应值最高，25%鸭肉掺假、50%鸭肉掺假、75%鸭肉掺假逐渐降低，纯烤羊肉的响应值最低。图5B表明在烤羊肉掺假样品的挥发性成分中，醛类物质和醇类物质种类最多，为烤羊肉掺假样品挥发性物质的主要贡献者。

图5 5个烤羊肉掺假样品挥发性化合物含量图（A）和种类图（B）Fig. 5 Contents (A) and types (B) of volatile compounds in five adulterated roast lamb samples

醇类物质主要来源于脂肪氧化，脂肪氧化程度会随着温度升高而加强。在烤羊肉掺假样品中主要检测到的醇类物质多为饱和醇如戊醇、庚醇、己醇、壬醇、辛醇，饱和醇的嗅觉阈值较高，因而对烤肉的整体风味贡献较小，主要呈现出清新的花草香气[35]。己醇、 4-壬醇、戊醇和2-乙基-1-己醇含量随烤羊肉中烤鸭肉掺假比例的增加呈现增加趋势，为样品整体风味增添了青草香味。1-辛烯-3-醇、丁醇和2,3-丁二醇等随烤羊肉中烤鸭肉掺假比例的增加呈现降低的趋势。1-辛烯-3-醇属于不饱和醇类，其含量在烤肉香气中占比较高，可通过15-脂氧合酶催化二十碳五烯酸和12-脂氧合酶催化 花生四烯酸形成，主要呈现令人愉悦的蘑菇味和青 草香[36]。醛类物质是烤羊肉掺假样品挥发性物质的重要组成部分，含量比其他几类风味物质高，而脂肪的氧化、降解及Strecker氨基酸反应是醛类物质的主要来源。在烤羊肉掺假样品中几乎所有的醛类物质随着烤羊肉中烤鸭肉掺假比例的增加呈现降低的趋势。由于醛类物质普遍感觉阈值低，因而对烤羊肉掺假样品整体风味贡献值较大[37]。在烤羊肉掺假样品中，以己醛、壬醛、癸醛、(E)-2-壬烯醛、庚醛、辛醛等醛类物质的含量较高，这些C6～C9的醛类物质被证明多数呈现出脂肪味、水果味和青草味[38-39]。己醛是亚油酸的降解产物，主要呈现苹果香、生油脂味。壬醛是油酸氧化的产物，具有水果香气。苯甲醛可能来自于苯丙氨酸的降解[40]，呈现果香、苦杏仁味，能够赋予烤肉浓厚的脂香。酸类物质是脂肪氧化裂解或脂肪水解过程中变为低级脂肪酸而产生[41]， 酸类物质由于含量较低感觉阈值相对较高，对烤羊肉整体风味贡献值较小。己酸来源于己醇、己醛的氧化以及己酸酯的分解，在25%烤羊肉样品以及纯烤鸭肉样品中存在。乙酸作为一种糖类微生物代谢的衍生物，在肉烤制过程中可能来自于甘油和磷脂的降解[42]。酯类物质主要是酸类和醇类物质酯化反应的产物[43]。蛋白质水解、糖酵解、脂肪氧化以及内源酶作用也是酯类化合物形成的重要途径[44]。烤羊肉掺假样品中的酯类风味物质主要存在于纯烤羊肉样品中，以乙酸己酯、苯甲酸-2-乙基己酯为主。酮类化合物不仅是美拉德反应的产物，也可能是脂肪氧化的结果。主要酮类风味物质有3-羟基-2-丁酮、3,5-壬二烯-2-酮、1-辛烯-3-酮、3,5-辛二烯-2-酮，这些物质随着烤羊肉中烤鸭肉的掺假比例增加呈现增长趋势。酮类物质具有一定的气味，但酮类物质的嗅觉阈值比醛类物质高，因而对烤肉的整体风味贡献较小，主要表现为谷香味、杏仁味以及奶香味。赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸与葡萄糖或者果糖的反应是酮类化合物生成的主要途径。3-羟基-2-丁酮可能来自糖原的降解[45]，也可能是2-乙基乳酸脱羧反应的副产物[46]。杂环类化合物主要来源于美拉德反应、氨基酸的热降解以及硫胺素的热降解[47]，在烤羊肉掺假样品中只检测出 2-戊基呋喃。呋喃类化合物大都具有很强的肉香味，主要由硫胺素降解、焦糖化和碳水化合物降解产生[48]，而2-正戊基呋喃呈现水果香气[49]。烷烃类化合物以十二烷含量高，烷烃类物质对烤肉整体风味贡献较小。

2.2.2 GC-MS数据的PLS-DA

采用SIMCA 14.0软件对GC-MS数据进行PLS-DA，以寻找烤羊肉掺假样品特征挥发性成分。由图6a可知，纯烤羊肉，纯烤鸭肉分别位于第3、4象限，不同烤鸭肉掺假比例的烤羊肉样品分别在第1、2象限，差异没有纯烤羊肉、纯烤鸭肉明显，但可以区分。挥发性化合物对已构建的分析模型的贡献大小可由PLS载荷图反映。挥发性化合物离中心圆点和主要化合物团越远，说明其对已构建的模型贡献最大，从图6b可以看出，在烤羊肉掺假样品中1-丁醇（1）、十三醛（24）、1-庚醇（3）、十五烷（46）、2-甲氧基酚（51）、2-十一烯醛（15）、2-丁基-1-辛醇（8）等化合物在载荷图中的位置与纯烤羊肉在得分图中的位置相近，表明这些化合物为纯烤羊肉的主要挥发性物质。而2,4,6-三甲基辛烷（45）、3-壬酮（30）、十二烷（43）等挥发性物质分别为75%烤羊肉、50%烤羊肉以及25%烤羊肉的主要挥发性物质。苯甲酸-2-乙基己酯（40）、十九烷酮（32）、癸烷（42）、4-甲基壬烷（44）、2,5-二甲基-十三烷（48）、丙酸（38）、乙酸己酯（39）、6-甲基十三烷（49）、苯乙烯（50）等挥发性物质是纯烤鸭肉的主要挥发性物质。

图6 烤羊肉掺假样品挥发性化合物PLS二维得分图（a）和 二维载荷图（b）Fig. 6 PLS score plot (a) and loading plot (b) of volatile compounds in roast mutton adulterated with duck meat

2.3 掺假样品特征挥发性成分的筛选

采用有监督的PLS-DA进行分析时易产生过拟合现象，因此通过200 次响应的置换检验验证PLS-DA模型是否存在过拟合现象。如图7所示，置换检验得到R2为0.364，Q2为-0.65，Q2与Y轴的截距为负，表明该模型不存在过拟合现象，模型的预测能力好，能够胜任后续特征挥发性物质的筛选。

图7 PLS-DA模型的置换检验Fig. 7 Permutation test of PLS-DA model

权重重要性排序（variable importance for the projection，VIP）展示每个变量对样品分类的贡献大小，其中VIP值大于1的变量通常被认为是模型的重要标志化合物。VIP值越大的变量在判别过程中贡献越大，在样品之间的差异也越显著[28]。从图8可以看出，有23个香气组分VIP值大于1.0，可作为区分5个烤羊肉掺假样品的重要挥发性化合物。分别为3-壬酮、十四烷、2,4,6-三甲基辛烷、十四醛、2-丙基-1-庚醇、乙酸、己醛、十二烷、4-癸酮、1-辛醇、1-丁醇、1-戊醇、1-庚醇、甲苯、2-乙基-1-己醇、十三醛、2-十九烷酮、乙酸己酯、苯乙烯、丙酸、6-甲基十三烷、2,5-二甲基十三烷、2-甲氧基酚。以上挥发性物质能作为掺假羊肉的关键变量，可用于区分不同比例烤羊肉掺假样品。

图8 烤羊肉掺假样品挥发性化合物VIP排序图Fig. 8 VIPs of volatile compounds in roast mutton adulterated with duck meat

采用SPSS 25.0版软件对VIP值大于1的变量进行单因素方差分析，以P＜0.01表示具有极显著性差异，筛选不同掺假烤羊肉样品中的差异挥发性物质。综合分析，最终筛选出5种特征挥发性物质，分别为1-辛醇、1-戊醇、己醛、乙酸、十二烷。其中1-辛醇、1-戊醇、己醛、乙酸，作为脂肪氧化、裂解产物，与鸭腿、羊腿肌肉中的脂肪含量有关，十二烷来源目前不详。这5种物质可作为建立烤羊肉掺假烤鸭肉比例分析的定量关系式的主要因变量。在肉类的特征挥发性物质当中，浓度以及感觉阈值共同决定了挥发性物质对于样品总体气味的贡献大小，因此对5种特征挥发性物质做ROAV分析结果如图9所示[31]。由图9可知，在5种特征挥发性物质中，己醛对样品香气贡献率最高，乙酸次之。

图9 特征挥发性物质的ROAV热图Fig. 9 Heat map of ROAVs of characteristic volatile compounds

3 结 论

采用GC-MS、电子鼻并结合化学计量学方法对5个烤羊肉掺假烤鸭肉样品进行分析鉴别，PCA可对5个样品进行区分，PLS-DA筛选出5个掺假样品中5种差异极显著挥发性风味物质。证实了一些重要化合物的含量在5个烤羊肉掺假样品中存在显著差异，这也是5个掺假样品具有各自独特香气特征的原因。该方法比传统的感官评价方法更客观、高效、准确，可为烤羊肉的质量鉴别与品质控制提供有效的鉴定方法。后续实验还可以进一步考察这5种挥发性差异物质与烤羊肉产假比例的定量关系，建立定量关系式，为准确的掺假比例提供依据。