QuEChERS技术结合超高效液相-串联质谱同时测定薄皮甜瓜中7种葫芦素

王 琦，岳 宁，李晓慧，李敏洁，苏 杭，李春梅，王怀松，付秋实，王 静，金 芬,*

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081；2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

甜瓜（Cucumis meloL.）是葫芦科一年生蔓性草本植物，是全球最重要的园艺作物之一。甜瓜以果实甘甜而著称，香气浓郁、风味独特，含有蛋白质、碳水化合物、维生素等多种营养素，在我国果蔬生产和消费中占据重要地位[1-2]。据联合国粮食及农业组织数据库显示，2018年全球甜瓜面积为104.73万 hm2，产量达 2 734.92万 t，分别占世界水果面积和产量的1.54%及3.15%[3]。中国作为全球甜瓜最大的生产和消费区，其产量约占世界甜瓜产量的一半（48%）[4-5]。目前，甜瓜已成为我国带动农民增收的高效园艺作物和主要时令水果，其产业重要性日益提高[6]。

葫芦素是甜瓜中苦味物质的主要成分之一，是一类高度氧化的四环三萜化合物[7-8]。葫芦素在甜瓜的抗虫、抵抗逆境过程中发挥了重要作用；同时还具有抗炎、抗肿瘤等多种生物活性，具有潜在的药用价值。葫芦素B是甜瓜中葫芦素的主要成分，其抗肿瘤活性更强[9-12]。现有葫芦素的检测方法多为高效液相色谱法，检测种类少、时间长、灵敏度低、基质干扰重，同时对甜瓜中其他微量葫芦素的组成和含量的研究少[13-14]；而液相色谱-串联质谱法因其灵敏度高、特异性强，成为目前测定葫芦素物质的首选检测方法。然而，已有的液相色谱-串联质谱法更多的关注葫芦素B、E等在大鼠血液中的药代动力学分布，而对含量较低、活性较高的葫芦素没有可用的检测方法，缺乏综合整体评价[12,14-19]。

QuEChERS法作为一种简便、快速、安全、价格低廉的分析方法，已成功用于果蔬中农药残留的分析。近年来该方法在天然有机物提取及分析中的应用越来越多，特别是在活性物质的提取和分析，如坚果中的生育酚及甾醇、五味子中木脂素成分[20-21]。为更准确地表征甜瓜中葫芦素的种类及含量分布，本研究利用高效液相色谱-串联质谱技术结合分散固相萃取前处理方法，建立同时测定甜瓜中7种主要葫芦素的检测方法，并对不同成熟期甜瓜中的葫芦素含量进行分析。该方法稳定、灵敏度高、分析周期短，可为甜瓜中葫芦素活性成分的提取及分析提供有效的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

薄皮甜瓜459由中国农业科学院蔬菜花卉研究所甜瓜课题组提供。

色谱级标准品：葫芦素B（纯度＞97%，CAS#6199-67-3），葫芦素D（纯度＞90%，CAS#3877-86-9），葫芦素E（纯度＞95%，CAS#18444-66-1），葫芦素B 2-O-β-D-葡萄糖苷（纯度＞92%，CAS#65247-27-0），葫芦素IIA（纯度＞98%，CAS#58546-34-2），葫芦素I（纯度＞98%，CAS#2222-7-3）和异葫芦素B（纯度＞95%，CAS#17278-28-3） 上海源叶生物技术有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA，50 μm）、十八烷基键合硅胶（C18，50 μm）分散固相萃取吸附剂、乙酸铵（色谱级） 美国Sigma-Aldrich 公司；氧化锆包覆硅胶（Z-Sep，50 μm）、碳十八键合锆胶（Z-Sep+，50 μm） 美国Supelco公司；甲酸（色 谱级） 美国Fisher公司；无水硫酸镁、氯化钠（均为分析纯） 北京化工厂；0.22 μm有机系滤膜 天津博纳艾杰尔公司；所有分离用有机溶剂均为国产色谱纯；实验用超纯水由 Milli-Q Advantage A10系统制备。

1.2 仪器与设备

Nexera LC液相系统、LC-MS8060三重四极杆质谱（配有电喷雾离子源及LabSolutions数据处理系统） 日本岛津公司；ME104分析天平 瑞士Mettler Toledo 公司；Vortex-Genie 2涡旋混匀器 美国Scientific Industries公司；Sorvall ST8R高速冷冻离心机 美国Thermo公司；Milli-Q超纯水器 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

标准储备液（1 mg/mL）配制：准确称取7种葫芦素标准物质各10.0 mg，用甲醇分别溶解定容至10.0 mL，于-18 ℃冷冻保存。

标准混合储备溶液（10 μg/mL）配制：分别取标准储备液1.0 mL混合，用甲醇定容至100 mL，于-18 ℃冷冻保存。

标准工作液配制：使用时将葫芦素标准储备液使用乙腈逐级稀释成所需质量浓度标准工作液或混合标准工作液。

1.3.2 样品前处理

选取未成熟期（授粉后25 d）及成熟期（授粉后34 d）甜瓜为实验材料，随机采摘代表性完整甜瓜果实8～12个，去蒂去籽后加入液氮粉碎，准确称取5.00 g粉碎后甜瓜样品于50 mL塑料离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋振荡3 min后，4 ℃、8 000 r/min离心10 min；取1 mL上清液加入装有50 mg PSA和50 mg C18的离心管中，充分涡旋振荡2 min，5 000 r/min离心5 min后取上层清液过0.22 μm有机滤膜后，使用乙腈稀释至合适浓度上机 检测。

1.3.3 色谱条件

XBridge C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；柱温40 ℃；进样量2 μL；流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸加5 mmol/L乙酸铵溶液，流速为0.20 mL/min。梯度洗脱：0～2.0 min，30% A，70% B；2.0～5.0 min，由30%～60% A，70%～40% B，保持1 min；6.0～10.0 min，60%～100% A，40%～0% B，保持2 min；12.0～12.5 min，100%～30% A，0%～70% B，保持3.5 min，总分析时长16 min。

1.3.4 质谱条件

电喷雾离子源；正负离子切换模式；多反应监测模式；离子喷雾电压4.0 kV；雾化气为氮气，流速 3.0 L/min；干燥气为氮气，流速10 L/min；碰撞气为氩气；脱溶剂管温度250 ℃；加热模块温度400 ℃。7种葫芦素的检测参数见表1。

表1 7种葫芦素的的保留时间与质谱参数条件Table 1 Mass spectrometric parameters and retention times for seven cucurbitacin standards

2 结果与分析

2.1 质谱参数优化

本研究采用注射泵直接将标准溶液注入离子源的方式对7种葫芦素质谱参数进行优化。分别将7种葫芦素质量浓度为0.1 mg/L标准工作液以10 μL/min的流速将标准工作液注入离子源，离子源为电喷雾离子源。正负离子模式下7种葫芦素的一级质谱图如图1所示，在正离子模式下，葫芦素B 2-O-β-D-葡萄糖苷、葫芦素IIA、葫芦素B、异葫芦素B和葫芦素E在一级质谱中易形成 [M+Na]+离子，这与相关报道一致[18,22-23]，但由于 [M+Na]+离子并不稳定，在定量分析过程中离子化程度波动较大，从而可能引起较大的定量偏差；而当在流动相中添加5 mmol/L乙酸铵时，Na+被NH4+取代，形成更加稳定且响应较高的[M+NH4]+离子，响应强度较 [M+Na]+离子提高1.5～2.5 倍[23-24]。而在葫芦素D与葫芦素I的一级质谱图中，[M+H]+和[M+HCOO]-离子峰响应较高（图1f、g）。这可能与葫芦素B 2-O-β-D-葡萄糖苷、葫芦素IIA、葫芦素B、异葫芦素B和葫芦素E五种葫芦素结构均含有酯键相关，有研究表明结构中含有酯键的化合物在质谱电离过程中易形成[M+NH4]+离子[25]；而葫芦素D与葫芦素I在结构中不存在酯键，因此分别形成[M+H]+、[M+HCOO]-准分子离子峰[22,25]。最终优化的质谱条件如表1所示。

图1 正负离子模式下的7种葫芦素的一级质谱图及结构式Fig. 1 Structural formulae and primary mass spectra of seven cucurbitacin standards

2.2 色谱条件优化

葫芦素B和异葫芦素B为同分异构体结构，由表1可知，在质谱上无法通过离子对对其进行区分，因此需要对色谱条件进行优化，实现色谱分离。本研究使用C18色谱柱对7种葫芦素进行分离，7种葫芦素都达到了基线分离，如图2所示；此外，比较甲醇和乙腈作为流动相对7种葫芦素的分离及响应，发现当使用乙腈为流动相时，7种葫芦素响应较甲醇作为流动相时提高1.2～1.5 倍；当在流动相中添加甲酸后，葫芦素D离子化程度更高，且灵敏度增加27%；乙酸铵的加入改善了葫芦素B 2-O-β-D-葡萄糖苷、葫芦素IIA、葫芦素B、异葫芦素B和葫芦素E的峰形。综合考虑灵敏度和色谱峰形等，最终确定采用乙腈和0.1%甲酸加5 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相进行梯度洗脱，在此条件下，7种葫芦素的色谱峰峰形良好，基质干扰小。

图2 7种葫芦素标准溶液总离子流图Fig. 2 Total ion current chromatograms of seven cucurbitacin standards

2.3 前处理优化

本实验比较优化了5种不同吸附剂（PSA、C18、GCB、Z-Sep、Z-Sep+）及不同含量的吸附剂组合的添加量。使用与甜瓜质地相似的苹果作为空白基质，按照1.3.2节进行前处理，收集第1次离心上清液，使用上清液配制1 mL 7种葫芦素标准液样品溶液（0.1 mg/L），后续步骤按前处理步骤进行，分别计算其回收率，确定吸附剂种类及添加量。当分别使用100 mg Z-Sep、Z-Sep+时，结果如图3a所示，Z-Sep及Z-Sep+两种吸附剂对7种葫芦素均有强烈吸附作用，回收率很低（分别低于9%和10%）；当使用GCB作为吸附剂时，7种葫芦素回收率为17%～74%，这与目标化合物中含有苯环平面结构，导致与GCB形成了强吸附相关[26-27]；而当采用PSA和C18用作吸附剂时，7种目标葫芦素的回收率分别为77%～103%和94%～111%，PSA对色素、有机酸、脂肪酸及糖等极性干扰物的去除效果好，C18可用于去除极性较小的化合物，基本可满足净化需求[28-29]。

为了进一步提高甜瓜样品的净化效率，采用PSA和C18组合对甜瓜中7种葫芦素回收率的影响进行评价。如图3b所示，当添加PSA和C18的含量分别为100 mg时，葫芦素E和葫芦素I的回收率受到严重影响，分别为62%和58%。而降低PSA和C18的含量，添加50 mg PSA和50 mg C18时，回收效果较好，7种葫芦素的回收率为81%～113%。因此，综合考虑回收净化效果以及实验成本，选择在1 mL提取液中使用50 mg PSA和50 mg C18作为吸附剂，用以净化甜瓜基质，降低基质效应。

图3 葫芦素在5种不同吸附剂（a）和不同使用量的组合吸附剂（b）中的添加回收率Fig. 3 Effects of five different sorbents, separately (a) and in combination (b), on recoveries of cucurbitacins

2.4 方法验证

2.4.1 线性范围和检出限

在0.1～1 500 μg/L质量浓度范围内配制7种葫芦素的混合标准溶液，以目标物的峰面积（y）对其相应的质量浓度（x）分别绘制标准曲线，按3 倍信噪比得到目标化合物的检出限，10 倍信噪比得到目标化合物的定量限，结果如表2所示，7种葫芦素检出限及定量限分别为0.16～4.33 μg/kg和0.27～13.11 μg/kg，线性相关系数均大于0.999，与文献中报道的水平相当[22,30]。

表2 7种葫芦素在甜瓜中的添加回收率及精密度Table 2 Spiked recoveries and precision for seven cucurbitacins

2.4.2 回收率和精密度

同时使用与甜瓜质地相似的苹果作为空白基质进行加标回收实验，按照1.3.2节样品前处理方法制备样品，平行实验5 次，分别在20、100 μg/kg和500 μg/kg 3个水平进行添加7种葫芦素的混合标准溶液，计算加标回收率和相对标准偏差，结果见表2。7种葫芦素的加标回收率分在75.7%～118.3%之间，相对标准偏差在0.5%～13.6%之间，其日内及日间相对标准偏差分别小于6.8%、8.3%，能够满足日常检测需求。

2.5 实际样品的检测结果

使用1.3.1节方法对不同成熟期的甜瓜进行处理，研究发现除异葫芦素B外，其余6种葫芦素在授粉后25 d及授粉后34 d甜瓜中都可被检测到，且授粉后34 d甜瓜中葫芦素总含量较高，为52.24 mg/kg，授粉后25 d甜瓜总葫芦素含量为46.34 mg/kg（表3）。在不同成熟期甜瓜中，葫芦素B 含量较高，占总含量的65.0%～65.5%；其次是葫芦素B 2-O-β-D-葡萄糖苷，占总葫芦素含量29.9%～31.7%；其余葫芦素含量均相对较低，总占比不足总量5%。

表3 实际样品中7种葫芦素测定结果及稀释倍数（n=4）Table 3 Results of determination of cucurbitacin contents in unripe and ripe melons and corresponding dilution folds (n = 4)

3 结 论

本实验采用改良的QuEChERS方法结合超高效液相色谱-串联质谱建立同时对甜瓜中7种葫芦素的分析方法，对其质谱条件、色谱条件及提取条件进行优化，在一级质谱中根据7种葫芦素不同结构性质选择了响应较高的准分子离子峰；以乙腈和0.1%甲酸加5 mmol/L 乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱；并优化选择了50 mg PSA及50 mg C18作为吸附剂对甜瓜基质进行净化，7种葫芦素的检出限及定量限分别为0.16～4.33 μg/kg和0.27～13.11 μg/kg，并使用该方法对不同成熟期甜瓜中的葫芦素进行分析。结果表明，方法前处理简便、灵敏度高、精密度好，可用于甜瓜中多种葫芦素的同时检测。