NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠成熟过程中理化品质及挥发性风味物质的影响

莫 然，唐善虎,*，李思宁，李锦锦，李琼帅，夏佳军，蔡寅川

（1.西南民族大学食品科学与技术学院，四川 成都 610041；2.阿坝藏族羌族自治州工业经济研究所，四川 阿坝藏族羌族自治州 624000）

肉制品是人类饮食中的重要组成部分，富含蛋白质、维生素以及矿物质[1]。牦牛肉是我国特有的肉 制品[2]，生产加工的牦牛肉制品，包括酱卤牦牛肉、牦牛肉干、牦牛肉肠等，深受广大消费者的喜爱。牦牛肉发酵灌肠是一种传统的发酵肉制品，从家庭制作到作坊加工再到大型食品加工厂的批量生产，因其独特的风味与口感，近年来备受青睐。但是，为了获得良好的口感以及较长的保质期，通常都要求添加一定的食盐。据研究报道，饮食中摄入过量盐，特别是NaCl，与高血压、心血管疾病[3]以及某些癌症如胃癌[4]等密切相关。

在肉制品加工中，NaCl在加工技术、贮藏和感官品质3个方面都发挥着重要作用[5]。近年来，国内外有许多学者致力于香肠等高盐含量腌制肉制品的减盐研究。如温荣欣等[6]报道了不同食盐添加量对哈尔滨风干肠脂质和蛋白氧化及挥发性化合物形成的影响；Zhao Bing等[7]也探讨了不同NaCl添加量对中国腊肠蛋白质氧化、脂质氧化和脂质分解的变化；Lobo等[8]开展了NaCl对发酵香肠中肉蛋白氧化还原化学机制的研究；Safa等[9]研究了直接减少NaCl含量以及减脂的互配对香肠蛋白水解、脂解、脂质和蛋白质氧化的影响。目前对香肠的减盐研究颇多，但是主要集中在NaCl的减少引起肉制品脂质氧化以及蛋白质氧化机制方面的研究。NaCl减少除了影响蛋白质和脂肪氧化外，同样影响肉制品其他品质特性。NaCl可以使肌原纤维蛋白溶解，提高肉的保水能力，并促进其在发酵香肠中形成凝胶，从而产生理想的质地[5]。此外，NaCl降低了水分活度，因此有助于控制微生物生长；还能调节成熟过程中的生化和酶反应，影响风味，提高咸味和肉味，改善挥发性香气化合物从食物基质的释放[8]，然而其效果与NaCl浓度密切相关[10]。

根据以往的工艺研究，灌肠中NaCl添加量一般在2.5%～4.0%较为常见[2-7]。本研究目的在于确定不同添加水平NaCl与牦牛肉灌肠理化特性及风味变化的关系。以不同NaCl添加量（0.0%、1.5%、3.0%、4.5%）的发酵牦牛肉灌肠为对象，通过测定4 组灌肠的pH值、保水性、色泽、质构、流变学特性、菌落总数、硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值、羰基含量、巯基含量以及挥发性风味物质的变化，探讨发酵牦牛肉灌肠发酵成熟过程（0、2、4、6 d和8 d）中的理化品质变化规律，旨在为减盐发酵牦牛肉灌肠制作和促进传统发酵肉制品的现代化改造提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 菌种、材料与试剂

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）均购于中国工业微生物菌种保藏中心。

牦牛肉购于四川省阿坝州红原县永源肉业，选取自然放牧状态下3 岁龄左右健康无病公牦牛背最长肌；猪肥膘、天然猪肠衣购于成都市武侯区洗面桥横街菜市场；食盐、白砂糖、亚硝酸钠、D-异抗坏血酸钠均为食品级。

MRS肉汤、MRS培养基、平板计数琼脂 杭州微生物试剂有限公司；2-硫代巴比妥酸、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸) 上海源叶生物科技有限公司；2,4-二硝基苯肼 成都市科隆化学品有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DHP-9052电热恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司；PHS-3C酸度计、UV1810S紫外分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；CR-400/410色差仪 日本Konica Minolta公司；TA-XT Plus质构仪 英国Stable Micro Systems公司；DISCOVERY HR-1混合流变仪 美国TA仪器公司；TRACE DSQ II型气相色谱-质谱联 用仪 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵牦牛肉灌肠的制备

参考白菊红等[2]的方法，确定发酵牦牛肉灌肠的工艺流程如下：

原料肉预处理→切块→拌料→腌制→绞肉→接种→灌肠→结扎、排气→主发酵→成熟→干燥→成品

本实验根据现有工艺，采取直接减盐的措施共制备4 组发酵牦牛肉灌肠，其中NaCl添加量分别为0.0%、1.5%、3.0%、4.5%。将牦牛肉与猪肥膘置于4 ℃冰箱缓慢解冻，牦牛肉剔除筋膜、筋腱，猪肥膘去皮，切成2 cm×2 cm×2 cm立方体，将牦牛肉与猪肥膘按质量比8∶2混匀，加入5 g/kg白砂糖、0.5 g/kgD-异抗坏血酸钠、0.5 g/kg亚硝酸钠以及不同质量分数NaCl（0.0%、1.5%、3.0%、4.5%）腌制12 h。腌制后使用绞肉机（6 mm孔板）绞碎，发酵剂（V（植物乳杆菌）∶V（干酪乳杆菌）=1∶1） 以108CFU/g接种于肉馅。经充分搅拌后，灌入猪小肠中，每根灌肠长约10 cm，直径约3 cm。洗净肠衣表面，扎孔排气，放入恒温培养箱中发酵成熟。发酵香肠加工工艺参数为：发酵温度30 ℃、发酵时间2 d，成熟温度20 ℃、成熟时间4 d，干燥温度45 ℃、干燥时间2 d。

1.3.2 样品采集

在发酵牦牛肉灌肠的生产加工过程中设置5个采样点，分别为：腌制后：原料肉腌制后绞碎接种发酵剂后的肉馅，即第0天；主发酵结束：从灌肠开始至主发酵2 d结束，即第2天；成熟中期：从主发酵结束至灌肠成熟2 d，即第4天；成熟结束：从主发酵结束至灌肠成熟4 d，即第6天；干燥结束：从成熟结束至灌肠干燥2 d，即第8天。每个采样点各取3 份样品用于指标测定。

1.3.3 pH值的测定

参考Vidal等[11]的方法，取5.0 g绞碎样品与45 mL蒸馏水混合，振摇30 s后浸提30 min，取滤液用pH计测定样品pH值并记录。

1.3.4 保水性的测定

参照Zhao Xinxin等[12]的方法，称取2～3 g牦牛肉灌肠，记录样品质量，用滤纸包裹放于10 mL带盖离心管内，4 ℃、10 000×g离心15 min后取出，再次称量样品质量，计算离心前后质量损失，得出保水性。

1.3.5 色泽的测定

灌肠去肠衣，均匀切成3 cm厚的片状置于白色滤纸上，于C光源下利用色差仪测定产品色泽。仪器经自检、调零以及白板校正后，将试样平铺样品板底部，无隙置于载物台上进行测量，选用L*a*b*测色系统，并记录样品的亮度值（L*）、红度值（a*）和黄度值（b*）。

1.3.6 质构的测定

参考赵芩[13]的方法并作适当修改。将牦牛肉灌肠切成3 cm左右的均匀薄片，采用质构分析仪进行测定。参数设定如下：测前速率2.00 mm/s，测中速率1.00 mm/s，测后速率2.00 mm/s，模式Strain，压缩比50%，两次下压间隔时间5.0 s，负载类型为Auto(Force)-5.0 g。

1.3.7 流变特性的测定

参考彭新颜等[14]的方法并稍作修改。取2～3 g肉样，仪器经自校后，将灌肠肉糜样品置于流变仪测试平台上，采用夹具直径40 mm平行板，涂布均匀，赶走气泡并小心刮走夹具外多余样品，两平板边缘用硅油涂抹，防止水分蒸发。参数设定如下：振荡模式，频率1 Hz，应变1%，间距1 500 μm，样品从15 ℃线性升温至95 ℃，升温速率1 ℃/min，记录肉糜储能模量（G′）随温度升高的变化情况。

1.3.8 菌落总数的测定

按GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》[15]中的方法测定发酵牦牛肉灌肠菌落总数。

1.3.9 TBARS值的测定

参考阮一凡等[16]的方法并作适当修改。将灌肠去肠衣绞碎称取5.00 g，加入25 mL质量分数7.5%三氯乙酸溶液（含0.1%乙二胺四乙酸二钠），振摇45 min，4 ℃、6 000 r/min离心5 min，取5 mL上清液，加入5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液，在沸水浴中保温40 min，加入5 mL氯仿混匀，静置分层后吸取上清液，测定532 nm和600 nm波长处的吸光度A。空白组加入5 mL 7.5%三氯乙酸、5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液，其余同上。TBARS值按下式计算：

式中：V为样品溶液体积/mL；M为丙二醛摩尔质量（72.06 g/mol）；m为称量样品的质量/g；l为光程/cm；ε为摩尔消光系数（152 000 L/（mol·cm））。

1.3.10 肌原纤维蛋白的提取

参考Zhao Xinxin等[12]的方法提取肌原纤维蛋白。以牛血清白蛋白为标准，采用双缩脲法测定蛋白浓度。

1.3.11 羰基含量的测定

参考Vossen等[17]的方法。取1 mL 4 mg/mL肌原纤维蛋白溶液加入聚乙烯离心管中，然后加入1 mL 10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼溶液，室温下避光反应40 min，每隔15 min振荡混匀一次。此后，加入1 mL 20%三氯乙酸溶液并离心（12 000×g、5 min）除去上清液后，将沉淀用1 mL乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液洗涤3 次。加入3 mL盐酸胍溶液（6 mol/L），37 ℃下保温15 min溶解沉淀，离心（12 000×g、3 min）除去不溶物质，最后获得物在370 nm波长处测吸光度。对照组开始时只加入1 mL 2 mol/L HCl溶液，其余操作相同。使用摩尔吸光系数22 000 L/（mol·cm）计算羰基含量，以每毫克蛋白含羰基量表示，单位为nmol/mg。

1.3.12 巯基含量的测定

参考扈莹莹等[18]的方法，并适当修改。使用5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)法对肌原纤维蛋白巯基含量进行测定。取0.5 mL配制好的蛋白溶液（4 mg/mL）与4.5 mL Tris-甘氨酸缓冲液（含0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、4 mmol/L乙二胺四乙酸、8 mol/L尿素，pH 8.0）混合，混匀后加入0.5 mL 10 mmol/L 5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，空白对照为5 mL缓冲液和0.5 mL 5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)混合，在40 ℃恒温水浴锅中反应1 h后，在412 nm波长处测定溶液吸光度。使用摩尔吸光系数13 600 L/（mol·cm）计算巯基含量，以每克蛋白含巯基量表示，单位为nmol/g。

1.3.13 挥发性风味物质的测定

参考吴倩蓉等[19]的方法并适当修改。取2.5 g绞碎样品放入顶空瓶并压盖。50 ℃平衡30 min，固相微萃取针头插入顶空瓶中萃取10 min，再插入到气相色谱-质谱进样器，进样口温度220 ℃，解吸10 min。

气相色谱条件：色谱柱TG-WaxMS B，载气He，色谱柱起始温度50 ℃，保持2 min，先以15 ℃/min速率升温至100 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min速率升温至220 ℃，恒定流速1.0 mL/min。

质谱条件：接口温度220 ℃，质量扫描范围45～450 u。

定性、定量分析：所有化合物经NIST 11谱库检索，选择正反向匹配值均大于800的化合物进行定性分析；根据峰面积比例对化合物相对含量（%）进行定量分析。

1.3.14 关键挥发性风味物质的分析

采用相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）[20]对发酵牦牛肉灌肠关键挥发性风味的贡献进行分析。将对样品风味贡献程度最大的物质ROAVstan定义为100，其他物质ROAV计算公式如下：

式中：Ci为某挥发性成分相对含量/%；Ti为某挥发性成分的香气阈值；Tstan为风味贡献程度最大物质的香气阈值；Cstan为风味贡献程度最大物质的相对含量/%。

1.3.15 感官评定

邀请10 名食品专业的研究生组成评定小组，男女各半，作为感官评定员，感官评定之前明确本研究的目的、意义及感官评定的指标和需要注意的事项。将灌肠去肠衣，切成1 cm厚的片状，随机进行评定，每次评定由每个小组人员单独进行，相互不接触交流，两组样品评定之间提供无盐苏打饼干和清水漱口以清除口腔内残留的味道。

感官评定分数采用0～20 分制，评定的指标包括色泽（0 分表示色泽苍白或灰暗，20 分表示诱人亮红色）、外观（0 分表示难看、难以接受的形状，20 分表示有非常好的灌肠形状）、质地（0 分表示非常软或非常硬，20 分表示软硬适中、易于咀嚼且适口性好）、滋味（0 分表示非常咸或淡、有异味，20 分表示咸淡适中、无异味）、总体可接受性（0 分表示不能接受，20 分表示非常喜欢）5 方面。

1.4 数据处理与分析

用Excel 2016软件做数据统计与计算；运用SPSS 25软件中的描述统计计算平均数和标准差，采用方差分析和Duncan多重比较对数据进行差异显著性分析 （P＜0.05，差异显著），对挥发性风味物质进行主成分分析（principal component analysis，PCA）；利用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠pH值的影响

如图1所示，4种灌肠在发酵成熟过程中pH值有相似的变化趋势，这与Zhang Ying等[21]的研究结果相似。在0～2 d，pH值显著下降（P＜0.05），这一阶段是主发酵阶段，原料肉中的微生物以及接种的乳酸菌（植物乳杆菌和干酪乳杆菌）利用碳水化合物形成有机酸并积累，其中主要是乳酸[22]。在2～6 d，4 组灌肠的pH值均显著上升（P＜0.05），可能是因为灌肠中添加的乳酸菌产生脂肪酶和蛋白酶，分解脂肪和蛋白产生游离脂肪酸和氨基酸，同时伴随着脱氨等分解反应，当产酸速率低于产氨等碱性物质生成速率，以及成熟、干燥过程中水分含量逐渐下降，共同导致pH值有所回升[23]。NaCl添加量4.5%的灌肠与其余3 组灌肠的pH值存在显著差异 （P＜0.05），这与牛培阳等[24]的研究结果相似，可能是由于高NaCl含量对乳酸菌的产酸能力有所抑制，因而pH值相对较高。

图1 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠成熟过程中pH值的影响Fig. 1 Effect of NaCl addition on the pH of fermented yak meat sausages during maturation

2.2 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠保水性的影响

如图2所示，4 组灌肠保水性的变化趋势相同，均随着发酵时间的延长而不断增大。NaCl添加量0.0%～3.0%，灌肠保水性随NaCl添加量的递增而逐渐增加，在0～8 d期间3 组间保水性均差异显著 （P＜0.05），可以推测增加NaCl添加量对提高发酵牦牛肉灌肠保水性有一定作用。研究表明，较高的离子强度能够提高肌肉蛋白质的溶解性，促进蛋白质三维网络结构的形成[25]，使得灌肠中肉糜形成更好的凝胶网状结构，水分子通过物理作用嵌入到凝胶结构中，从而提高了对水分的束缚力[26]。在4～8 d，NaCl添加量3.0%的灌肠比4.5%灌肠保水性要好，可能是因为NaCl添加量3%时盐溶性蛋白含量最少，盐溶性蛋白溶解形成溶胶，使得水合作用更加充分，保水性增强。

图2 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠成熟过程中保水性的影响Fig. 2 Effect of NaCl addition on the water-holding capacity of fermented yak meat sausage during maturation

2.3 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠色泽的影响

如图3所示，在发酵前2 d由于微生物的作用，灌肠L*有上升趋势，随着时间延长，L*降低。而4 组灌肠之间，在6～8 d，NaCl添加量4.5%的灌肠比其余3 组灌肠L*显著较高（P＜0.05）。推测较高的NaCl添加量对提高肉制品L*有一定作用，而低水平的NaCl添加量对肉制品L*无显著影响。总体来说，加工时间以及NaCl添加量对4 组灌肠a*无显著影响（P＞0.05），这与Pietrasik等[27]对重组火腿的研究结果类似，盐含量的减少（1.8%～1.2%）对a*没有影响，但与De Oliveira Paula等[28]的结果相悖。随着时间延长，4 组灌肠b*在第8天与第0天相比显著下降（P＜0.05）。而未添加NaCl的灌肠b*显著高于其余3 组添加NaCl的灌肠（P＜0.05）；NaCl添加量1.5%～3.0%，灌肠b*呈下降趋势，这与O’Flynn等[29]的研究结果相似；NaCl添加量3.0%～4.5%，灌肠b*呈上升趋势，推测可能是肉类色素的氧化产物（由于盐含量的增加）呈现出更深的颜色[29]。

图3 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠成熟过程中色泽的影响Fig. 3 Effect of NaCl addition on the color of fermented yak meat sausages during maturation

2.4 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠质构的影响

由表1可知，4 组灌肠的硬度、胶着性、咀嚼性的变化趋势相似，均随着加工时间延长显著增大 （P＜0.05）。不同组间，随着NaCl添加量的减少，硬度、胶着性、咀嚼性下降（P＜0.05），说明NaCl添加量对于灌肠的硬度、胶着性、咀嚼性有一定影响。这可能是由于肌原纤维蛋白在高NaCl含量的肉糜中溶解度更大，而在凝胶形成过程中这些蛋白（尤其是肌球蛋白）的可用性直接影响肉品质地[28]。添加NaCl的3 组灌肠的弹性、内聚性较未添加NaCl灌肠有显著提升 （P＜0.05），这可能是因为NaCl能够提高乳化稳定性，增强蛋白质与蛋白质之间的作用力，从而提高保 水性[30]。而添加NaCl的3 组灌肠之间，随着NaCl添加量的增加，其弹性、内聚性无明显差异，这与闫艺等[30]对马肉肉糜的研究结果相似，这说明NaCl含量的减少对灌肠的弹性、内聚性影响不大。此外，NaCl添加量3.0%和4.5%的灌肠之间回复性无显著差异（P＞0.05），但均较其余组显著提高（P＜0.05）。

表1 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠成熟过程中质构的影响Table 1 Effect of NaCl addition on the texture of fermented yak meat sausages during maturation

本实验结果表明，NaCl添加量降为0%，对灌肠的硬度、胶着性、咀嚼性、回复性影响很大，与添加NaCl的灌肠相比，弹性、内聚性也有所下降，这是由于NaCl的加入增强了肌原纤维蛋白的溶解和提取以及蛋白质基质的相互作用，因此，形成的基质会在蒸煮后形成更硬的凝胶，这种蛋白质基质中黏稠的渗出液在烹饪过程中通过胶凝化使肉糜联结，从而改善肉品的质地[28]。随着NaCl添加量的减少，灌肠的硬度、胶着性、咀嚼性、 回复性随之下降。总的而言，NaCl的减少对发酵灌肠的质构特性会产生不利影响，但是NaCl添加量4.5%和3.0%灌肠的质构特性总体相差较小。

2.5 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠流变学特性的影响

弹性模量（G′）是反映溶液分子交联程度的参数，在一定程度上反映凝胶强度[31]。在动力学加热过程中，G′的变化可以表明蛋白质相互聚集速率的变化，反映蛋白结构解折叠和随后的凝集变化；肉蛋白形成热诱导凝胶的动态过程，伴随着一系列性质的变化，包括变性、凝集和三维网络结构的形成[31]。

图4A反映了第0天时牦牛肉灌肠在15～90 ℃加热过程中G′的变化，4 组灌肠G′曲线的变化趋势基本相似。15～50 ℃，G′下降，4 组灌肠的G′均在50 ℃达到一个低热变形峰点，可能是由于样品受热，大量肌原纤维蛋白发生溶解、溶胀和折叠，随后G′又上升，在68～75 ℃时达到高热变形峰点，随后急剧下降。50～75 ℃这一温度范围内G′上升可能是由于肉糜中肌球蛋白结构开始发生变化，肌球蛋白分子间头部与头部发生聚集，交联形成弹性网络结构[32]，峰值点所对应的温度较李德阳等[33]研究NaCl对大菱鲆肌原纤维蛋白特性影响的峰值温度（35～40 ℃）高，这可能与肉的品种相关。与第0天时不同，第2天时未添加NaCl灌肠G′曲线的热变形峰消失，而添加NaCl的3 组灌肠在65～70 ℃出现了较小的低热变形峰，NaCl添加量3.5%和4.0%灌肠的低热变形峰峰值近似相等，均低于NaCl添加量1.5%的灌肠，随着加热温度继续升高，G′曲线趋于平缓（图4B）。第4天和第6天时，NaCl添加量0%和1.5%的灌肠的热变形峰消失，仅NaCl添加量3.0%和4.5%的灌肠在70～75 ℃出现一个微弱的低热变形峰，且波形明显小于前2 d，之后随着温度的升高趋于平缓（图4C、D）。第8天时，4 组灌肠的热变形峰均全部消失，15～70 ℃范围内G′缓慢下降，70～90 ℃以后趋于平缓，且随着NaCl添加量的减少G′增大（图4E）。在2～4 d，出现低热变形峰的温度之前，添加NaCl灌肠的G′较未添加NaCl灌肠高，说明添加NaCl灌肠弹性较好；而6～8 d，未添加NaCl灌肠的G′较高，这可能与灌肠样品在后期硬度等质构特性较高有关。总体来说，发酵成熟过程中，NaCl添加量1.5%和3.0%灌肠的G′较好。

图4 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠G′的影响Fig. 4 Effect of NaCl addition on the storage modulus of fermented yak meat sausages

2.6 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠菌落总数的影响

如图5所示，在整个发酵成熟期间，4 组灌肠的菌落总数均呈先增加后降低的趋势（P＜0.05）。这是由于0～2 d牦牛肉发酵灌肠处于主发酵阶段，在适宜的温度及湿度下，乳酸菌作为发酵优势菌快速增长；之后4～6 d处于低温成熟阶段，温度下降，微生物活性受到抑制，后期营养物质减少、微生物可利用水分减少也抑制了灌肠中微生物的生长，此外，乳酸菌发酵产酸，低pH值在一定程度上可能会抑制某些微生物的生长，例如大肠杆菌[34]；而至8 d，由于高温干燥，灌肠中的微生物急剧下降。总体来说，NaCl添加量0.0%与1.5%、3.0%与4.5%的灌肠之间菌落总数差异较小，但低NaCl添加量（0.0%和1.5%）与高NaCl添加量（3.0%和4.5%）之间差异显著（P＜0.05）。这说明，NaCl添加量大幅度下降会促进微生物的生长，降低灌肠的贮藏品质；而适当降低NaCl添加量，对微生物的影响不大。这与Charmpi等[35]报道的添加4.0%盐肉糜中腐败微生物数量较添加0%～3%盐的肉糜要低的结果一致。

图5 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠成熟过程中菌落总数的影响Fig. 5 Effect of NaCl addition on the total bacterial count of fermented yak meat sausage during maturation

2.7 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠TBARS值的影响

肉制品中脂质氧化对产品特性有很大影响，会产生令人不愉快的气味和质地，以及导致部分必需脂肪酸的损失[36]。如图6所示，随着时间的延长，灌肠的TBARS值显著增加（P＜0.05）。在0～2 d，NaCl添加量对灌肠的TBARS值影响较小；在4～8 d，随着发酵、成熟、干燥的进行，4 组灌肠之间TBARS值差异显著 （P＜0.05），且随着NaCl添加量减少，TBARS值显著增加（P＜0.05）。另一方面，未添加NaCl灌肠较NaCl添加量1.5%和3.0%灌肠TBARS值低（P＜0.05），而较NaCl添加量4.5%灌肠的TBARS值高（P＜0.05）。在一定盐度范围内，盐作为一种促氧化剂[37]，随着NaCl添加量的增加，脂质氧化程度增加，因此NaCl添加量1.5%和3.0%的灌肠较未添加NaCl灌肠的TBARS值高。目前NaCl引发或催化脂质氧化的机理尚未完全阐明，其机制可能归因于NaCl破坏细胞膜完整性，促进氧化剂进入脂质基质，从含铁分子中释放铁离子，如血红素蛋白；或抑制抗氧化酶如过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性[38]。在本研究中，随着NaCl添加量从4.5%降低到1.5%，TBARS值升高，可能是由于盐促脂质氧化作用受离子浓度的影响，高浓度的离子环境反而会抑制脂质氧化的进行[39]，这与柴子惠等[40]的研究结果相似，高盐（6%）较低盐（4%）腊肉的TBARS值低，说明盐浓度对灌肠脂质氧化有一定影响。

图6 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠成熟过程中TBARS值的影响Fig. 6 Effect of NaCl addition on the TBARS value of fermented yak meat sausages during maturation

2.8 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠羰基、巯基含量的影响

蛋白质羰基的形成主要通过金属催化氧化、非酶糖化和其他物质与蛋白质络合3种途径[41]。肉中天然存在的金属离子，如Fe2+，可以刺激O2和H2O2产生氧自由基，是一种自由基链式反应。反应开始较慢，因为起始链反应的活化能较高，然后蛋白质氧化反应迅速，精氨酸、赖氨酸、脯氨酸和苏氨酸的侧链上产生羰基[7]。 因此羰基含量常被用来反映蛋白质的氧化程度。如 图7A所示，4 组灌肠的羰基含量均随着时间的延长而增加（P＜0.05）。随着NaCl添加量减少至1.5%，羰基含量呈递减趋势（P＜0.05），这与Zhao Bing等[7]的研究结果相似。这是由于肉制品中的NaCl能通过Fenton反应，将氧肟蛋白中的二价铁（Fe2+）改变为高铁肌红蛋白的三价铁（Fe3+），从而增加其亲氧化电位，随后形成活性氧，促进蛋白质的氧化[42]；另一方面，也可能是蛋白质的氧化还原状态受到离子驱动效应的影响[8]。而除0 d外，未添加NaCl与NaCl添加量4.5%灌肠的羰基含量无显著差异（P＞0.05），可能是由于盐含量较少，微生物数量增加，产生的外源蛋白酶作用于肌肉蛋白使其发生不同程度水解、氧化[43]。此外，脂质氧化产生自由基也会驱动蛋白质氧化[7]，而上述提到NaCl添加量超过一定范围会抑制脂质氧化的作用，因此两种作用综合导致NaCl添加量1.5%和3.0%灌肠中的羰基含量低于未添加NaCl灌肠。巯基含量是衡量蛋白质氧化的另一个常用指标，半胱氨酸的巯基对氧化过程非常敏感，它们的氧化导致二硫键形成；巯基含量越低，蛋白质的氧化程度越大[9]。如图7B所示，4 组灌肠的巯基含量均随着加工时间的延长而下降（P＜0.05）。随着NaCl添加量由4.5%减少至1.5%，巯基含量呈递增趋势（P＜0.05）；此外，未添加NaCl的灌肠与NaCl添加量4.5%的灌肠的巯基含量无显著差异（P＞0.05）。巯基含量的总体变化与羰基含量结果相同，随着NaCl添加量的减少，样品蛋白质氧化作用降低，这进一步说明NaCl对于肉制品蛋白质氧化有诱导作用，适量降低NaCl添加量有助于控制蛋白质的氧化，这与温荣欣等[6]的研究结果一致。

图7 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠成熟过程中羰基含量（A）和 巯基含量（B）的影响Fig. 7 Effect of NaCl addition on the protein carbonyl (A) and sulfhydryl (B) contents of fermented yak meat sausages during maturation

2.9 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠挥发性风味物质的影响

由表2可知，4 组灌肠在发酵成熟过程中共鉴定出131种挥发性风味物质。一般而言，发酵灌肠的风味受原料、发酵剂、加工方式等多种因素的影响[44]。而发酵牦牛肉灌肠的挥发性风味物质的产生途径主要有碳水化合物代谢、脂质氧化、氨基酸分解代谢、酯化等[45]。

表2 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠成熟过程中挥发性风味物质的影响Table 2 Effect of NaCl addition on volatile flavor compounds in fermented yak sausages during maturation

由于检测出的挥发性风味物质变量较多，对其难以进行系统分析，且发酵牦牛肉灌肠的总体风味贡献程度主要由感觉阈值和含量共同决定，因此采用PCA法简化数据，以得到不同变量之间的关系[46]，并通过ROAV法来确定所分析样品的关键风味化合物[20]。

由图8可知，构成发酵牦牛肉灌肠的挥发性风味物质有3个PC，其贡献率分别是31.360%、21.387%、17.891%，累计贡献率达70.638%，各PC的特征根均大于1，因此这3个PC能够较好地反映发酵牦牛肉灌肠在成熟过程中挥发性风味物质相对含量的变化。其中构成PC1主要为酸类、醇类、醛类、酯类；PC2主要为烯类、其他化合物；PC3为酮类物质。由得分散点图（图9）可以看出，不同发酵时间、不同组别的样品在PC上的得分具有差异，在发酵初期各组样品较为分散，添加了NaCl的灌肠在PC1上的得分最高，未添加NaCl的灌肠在PC2上的得分最高；而在成熟干燥后，4 组样品分布集中。

图8 挥发性风味物质的因子载荷分析图Fig. 8 PCA factor loading plot of volatile flavor substances

图9 样品在不同PC上的得分散点图Fig. 9 PCA score scatter plot of samples

不同发酵时间各样品关键风味贡献结果如图10所示。共确定12种关键风味物质（ROAV≥1），随着时间的延长，各加工阶段关键风味物质的种类呈递增趋势，这可能是由于初期微生物的代谢分解作用，产生醇类物质，而醇类物质不断生成醛类物质以及酸类物质，随着加工的进行以及温度的变化，脂质氧化、美拉德反应等加剧，使得风味物质含量增加[6]。

图10 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠成熟过程中ROAV的影响Fig. 10 Effect of NaCl addition on ROAV of fermented yak sausages during maturation

第0天腌制结束时，样品在PC2上的得分最高，主要由烯类和其他物质（包括苯类和含氮类化合物）构成。但是由于这两类物质感知阈值偏高，ROAV＜0.1，不被认为是关键风味物质。

第2～6天发酵、成熟期间，样品在PC1上的得分最高，主要由酸类、醇类、醛类、酯类构成。脂质氧化是发酵灌肠特有气味和风味形成的关键因素，负责形成脂肪族醛、酮、烷烃及其相应的酸、酯和醇等重要挥发性物质[47]。随着加工的进行，醛类物质的相对含量呈递增趋势，NaCl添加量1.5%和3.0%灌肠的醛类物质相对含量最高，其次是未添加NaCl的灌肠，而NaCl添加量4.5%的灌肠最低。在发酵牦牛肉灌肠中主要检出己醛、壬醛、异戊醛、庚醛等，这些物质主要源于脂质氧化[47]。这说明低NaCl添加量对脂质氧化有促进作用，而相对较高的NaCl添加量对脂质氧化有一定的抑制作用，与TBARS值结果一致。由于醛类物质如己醛、壬醛、异戊醛等感知阈值较低[48]，且相对含量较高，因此成为发酵牦牛肉灌肠的关键风味物质。醇类、酸类、酯类物质主要是由发酵成熟过程中微生物的代谢作用产生[47]。醇类和酯类物质种类较多，发酵初期相对含量较大，不同NaCl添加量的灌肠间变化趋势不明显。而在检出的醇类物质中，仅有1-辛烯-3-醇为关键风味物质（ROAV≥1），1-辛烯-3-醇具有蘑菇香、花香，是香肠风味中最具代表性的不饱和醇[49]，其合成的代谢途径包括甲基酮还原、氨基酸代谢和脂质氧化[50]。

第8天干燥结束时，样品在PC3上的得分较高，由酮类物质构成。在被检测出的酮类物质中只有3-羟基-2-丁酮作为关键风味物质，且仅在3个样品中检测到。NaCl添加量4.5%的灌肠酮类物质相对含量在加工后期远高于其他组，一般而言酮类物质的产生是由于脂肪酸的β-氧化产生[50]，由此可以推测第8天，NaCl添加量4.5%的灌肠β-氧化作用较强。

2.10 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠感官品质的影响

不同NaCl添加量的发酵牦牛肉灌肠（8 d）感官评分如表3所示。随NaCl添加量的减少，发酵牦牛肉灌肠的外观、质地、滋味、总体可接受性的感官评分均呈下降趋势（P＜0.05），但NaCl添加量3.0%和4.5%的灌肠之间差异不显著（P＞0.05）。这说明NaCl添加量影响灌肠的感官品质，这与Fellendorf等[51]研究的钠盐含量对白布丁香肠的感官分析结果相似。而色泽评分，除NaCl添加量4.5%的灌肠较其他灌肠高（P＜0.05），其余组间均无显著差异（P＞0.05）。综上，直接降低盐含量会影响牦牛肉发酵灌肠的感官评分，而适量的减少其总体可接受性无显著变化。

表3 NaCl添加量对发酵牦牛肉灌肠感官评分的影响Table 3 Effect of NaCl addition on sensory evaluation of fermented yak meat sausages

3 结 论

本研究中4 组灌肠在发酵成熟过程中理化性质、菌落总数以及挥发性风味物质的变化趋势大致一致。NaCl添加量为4.5%的灌肠的pH值和L*最高，而NaCl添加量3.0%的灌肠保水性最好且b*最低；随着NaCl添加量的减少，硬度、胶着性、咀嚼性呈下降趋势，而G′、菌落总数呈上升趋势。此外，NaCl添加量对灌肠的脂质、蛋白质氧化有一定影响，随着NaCl添加量从4.5%减少到1.5%，脂质氧化程度增加，而蛋白质氧化程度降低。发酵牦牛肉灌肠中共检出7 大类挥发性风味物质，通过PCA得到3个PC，累计贡献率达70.638%，ROAV法分析得到12种关键挥发性风味物质（ROAV≥1），不同加工时间各样品的得分情况不同，且随着NaCl添加量从4.5%减少到1.5%，其脂质氧化产物醛类的相对含量增大。另外，发酵牦牛肉灌肠的外观、质地、滋味、总体可接受性的感官评分随NaCl添加量从3.0%到0.0%的减少呈下降趋势（P＜0.05），而NaCl添加量为3.0%和4.5%的灌肠之间差异不显著（P＞0.05）。综合分析，直接减少NaCl添加量对产品的品质有一定的影响，但减少至3.0%产品在可接受范围内，且脂质氧化、蛋白质氧化情况适中。