化学助剂对杨木酶水解及发酵制备枯草芽孢杆菌的影响∗

2022-03-05魏立婷贾丽丽张军华

林产工业 2022年2期

魏立婷贾丽丽张军华

（西北农林科技大学林学院，陕西杨凌 712100）

我国杨木资源丰富，分布广泛，多用于纸浆造纸、家具制造等行业。加工杨木时会产生大量废弃物，为避免资源浪费，将杨木加工废弃物作为生物质化学品的生产原料[1-3]。前期研究发现，杨木经乙酸和乙酸-过氧化氢两步预处理后，可脱除大量木质素，减少木质素对纤维素酶的吸附，有利于后续水解[4]。同时研究表明，添加适量酶水解助剂可提高水解性能[5-8]，然而目前有关酶解助剂对后续发酵过程的影响缺少深入的研究。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）生长速度快且易存活[9]，将其引入动物体内可以改善肠道微生态平衡，抑制有害菌生长，提高动物生长性能，可作为替代抗生素的饲料添加剂[10-13]。Wolfenden等[14]发现，饲料中添加枯草芽孢杆菌PHL-NP123可使肉仔鸡体重增加，同时也使肠道中沙门氏菌减少了25%。Giang等[15]发现，多种复合微生物添加剂可提高仔猪采食量和回肠消化率，平均日增重增加5.9%。陈慧慧[16]以杨木木屑水解液为发酵基质，通过木醋杆菌发酵进行细菌纤维素的制备，最高产量可达3.14 g/L。因此若以农林废弃物转化制得的单糖作为微生物发酵碳源，可以进一步促进废弃物料的高值转化。

本试验以乙酸-双氧水预处理杨木残渣为底物，添加β-葡萄糖苷酶（BG）和表面活性剂吐温-80、PEG-6000、木质素磺酸钠为辅助剂进行酶水解，对比研究最优水解条件，并以纤维素酶水解液中单糖为碳源，添加适量表面活性剂进行枯草芽孢杆菌发酵培养，以提高活菌数，降低生产成本，为生物质的高效利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

杨木屑，购自江苏宿迁，经粉碎过60目筛（孔径＜0.25 mm），冷藏于-20 ℃冰箱保存。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）YS01，由南京林业大学生物工程系生物化工研究所提供。

纤维素酶Cellic Ctec2（酶活为123 U/g，蛋白含量为176.2 mg/mL）和β-葡萄糖苷酶Novozyme 188（酶活为1 714 U/mL），购自丹麦诺维信（Novozymes）公司。标准品葡萄糖和木糖为色谱纯，购于Sigma-Aldrich公司。其他化学试剂均为分析纯。

1.2 设备

Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；ZQTY-50S型振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；UV-1800 型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

1.3 培养基

琼脂平板培养基：蛋白胨0.5%，酵母膏0.25%，葡萄糖0.1%，琼脂1.5%，pH调至7.0±0.2。

种子培养基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠 1%，pH调至7.1±0.2。

发酵培养基：酶水解液中葡萄糖和木糖总和1%，蛋白胨1%，磷酸氢二钾0.15%，硫酸锰0.01%，硫酸镁0.05%，无水氯化钙0.06%，pH调至7.0±0.2。

1.4 试验方法

1.4.1 杨木预处理

预先用乙酸对杨木进行第一步预处理（5%浓度乙酸，常温处理1 h，170 ℃加热30 min），脱除半纤维素，制备低聚木糖[4,17]，预处理残渣水洗至中性后用乙酸-双氧水进行第二步预处理，乙酸-双氧水浓度为80%，其中双氧水与乙酸体积比为1∶1，60 ℃加热2 h，第二步预处理残渣用蒸馏水洗至中性，备用。

1.4.2 杨木酶水解

称取6.0 g干物质的两步预处理杨木残渣，柠檬酸钠缓冲溶液（pH 5.0）补足体系，配成300 mL 2%底物浓度的水解液，在10 FPU/g DM的纤维素酶CTec2 基础上，分别添加β-葡萄糖苷酶和吐温-80、PEG-6000、木质素磺酸钠。在50 ℃、200 r/min条件下水解72 h，反应结束后将酶解混合物真空过滤，除去残渣得酶解液。每次试验做3 个平行，结果取平均值。

1.4.3 杨木酶水解液发酵

以未添加酶水解助剂时酶水解液中的单糖作为发酵培养基的碳源，并向培养基中添加不同浓度的吐温-80、PEG-6000、木质素磺酸钠，进行枯草芽孢杆菌发酵培养。本试验以吸光值（OD600）和活菌数作为评价饲用枯草芽孢杆菌发酵性能的主要指标，同时还可结合单糖消耗情况，判定菌株对培养基营养物质的吸收能力。

1.4.4 枯草芽孢杆菌培养方法

菌株活化：将保存的枯草芽孢杆菌YS01 接种到琼脂平板培养基中，37 ℃恒温培养箱培养18 h。

种子培养：挑取单菌落接种到种子培养基，在37 ℃、200 r/min条件下摇床培养24 h。

发酵培养：接入5%种子液于发酵培养基中，在37 ℃、200 r/min条件下摇床培养24 h。

1.4.5 糖含量测定

样品中葡萄糖、木糖含量用高效液相色谱进行分析。色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87P（300 mm×7.8 mm）分析柱，检测器为示差折光检测器，采用5 mM的H2SO4作为流动相，流速为0.5 mL/min，样品稀释后过0.22 µm的水系滤膜。

1.4.6 吸光度测定以未接种的培养基作空白对照，取发酵液1 mL，无菌水稀释后测定吸光度(OD600)。

1.4.7 活菌数测定

按照GB/T 13093—2006《饲料中细菌总数的测定》对活菌数进行测定。取发酵液1 mL稀释至10-6～10-8，涂布平板计数，3 个平行，倒置培养24 h确定活菌数。每次试验重复3 次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 预处理后的杨木化学组分和结构分析

按照文献[4]的方法进行乙酸、乙酸-过氧化氢两步预处理，预处理前后杨木主要成分和结构如表1。乙酸处理可脱除部分木聚糖，低木聚糖得率明显提高，可用于制备低聚木糖。但是疏水性高于未处理杨木，使得木质素更易吸附纤维素酶，影响酶水解得率。乙酸预处理残渣进行乙酸-过氧化氢两步预处理后，木质素大量脱除，纤维素相对含量增加，结晶度升高到64.2%，有利于酶水解。

表1 乙酸、乙酸-双氧水预处理对杨木化学组成和结构的影响Tab.1 Chemical compositons and structure of AC and HPAC pretreated poplar

2.2 辅助剂对杨木酶水解的影响

2.2.1β-葡萄糖苷酶对酶水解的影响

乙酸-双氧水二次预处理杨木在水解时产生较高浓度的纤维二糖，抑制纤维二糖水解酶的作用，导致酶解得率降低[18-19]。因此，向水解液中加入适量β-葡萄糖苷酶可降低纤维二糖浓度，缓解其对酶解的抑制。

图1 所示为β-葡萄糖苷酶的添加量对杨木酶解影响情况。结果表明，随着反应时间的延长，酶水解转化率稳步提升，且单糖得率随β-葡萄糖苷酶添加剂量的增加有不同幅度的增加，其中木糖得率增幅较大。加入500 nkat/g含量的β-葡萄糖苷酶水解72 h，葡萄糖和木糖得率分别从68.25%和85.85%提升到71.39%和90.57%。当β-葡萄糖苷酶含量增加到1 000 nkat/g，葡萄糖和木糖得率均为最高，分别为74.35%和95.43%，说明添加β-葡萄糖苷酶能有效促进纤维素酶解。

图1 β-葡萄糖苷酶对杨木酶水解的影响Fig.1 Effect of β-glucosidase on the hydrolysis of pretreated poplar

2.2.2 吐温-80 对酶水解的影响

随后考察吐温-80 对预处理杨木酶水解得率的影响，结果如图2 所示。添加0.5 g/L的吐温-80 酶水解72 h，葡萄糖得率由64.10%提升至73.01%，当添加量增加到1 g/L，葡萄糖得率进一步提升到78.85%，然而继续增加吐温-80 的浓度未能显著提高葡萄糖得率。

图2 吐温-80 对杨木酶水解的影响Fig.2 Effect of Tween-80 on the hydrolysis of pretreated poplar

酶水解木糖得率也得到相同结果，吐温-80 剂量为1 g/L时，酶水解72 h木糖得率最高为95.35%。另外，酶水解时间从48 h延长至72 h，半纤维素水解效率逐渐放缓，木糖得率难以提高。考虑到吐温-80 含量过多不利于酶的回收，且增加生产成本，因此，水解过程中表面活性剂吐温-80 的最适添加量1 g/L。

2.2.3 PEG-6000 对酶水解的影响

与添加吐温-80 的结果相似，随着底物中非离子表面活性剂PEG-6000 含量增加，单糖得率均较未添加PEG-6000 样品有所提高。由图3 可知，PEG-6000浓度从0.5 g/L增加到1 g/L，酶解72 h葡萄糖得率和木糖得率均相差不大，说明微量的PEG-6000 对酶水解促进效果不显著。但当PEG-6000 添加量增加到1.5 g/L，葡萄糖和木糖得率较未添加样相比，分别提高了25.64%和22.99%。主要原因是PEG-6000 中的亲水性基团可对纤维素酶产生诱导[20]，释放活性，减少木质素与纤维素酶之间的静电吸引，同时PEG-6000 能够改善固液传质，加速底物与酶运动[21]，从而增加底物与酶的吸附-解吸速率，提高预处理杨木酶水解效率。因此可选用1.5 g/L浓度PEG-6000 作为化学激活剂加入到酶水解试验中。

图3 PEG-6000 对杨木酶水解的影响Fig.3 Effect of PEG-6000 on the hydrolysis of pretreated poplar

2.2.4 木质素磺酸钠对酶水解的影响

考察1、5 g/L浓度木质素磺酸钠对杨木残渣酶水解效率的影响，结果如图4 所示。随着酶水解的进行，酶水解得率快速升高。在3 种酶水解反应中，酶水解效率均在反应72 h时达到最高值。另外，5 g/L浓度的木质素磺酸钠单糖得率最高，葡萄糖、木糖得率分别为70.18%、94.72%，说明添加木质素磺酸钠对酶解反应有促进作用，酶水解后得到更多的单糖，可为木质纤维原料的生物转化提供能源。木质素磺酸钠中磺酸基团的负电子与纤维素酶中带正电的氨基结合，形成“水包油”型胶束[22-23]，从而使纤维素与纤维素酶连接更稳定，阻碍酶与底物接触，提高酶水解效率。因此，选择木质素磺酸钠的适宜浓度为5 g/L。

图4 木质素磺酸钠对杨木酶水解的影响Fig.4 Effect of sodium lignosulfonate on the hydrolysis of pretreated poplar

2.3 表面活性剂对枯草芽孢杆菌发酵的影响

培养基的碳源来自未添加酶助剂时酶水解液中的葡萄糖和木糖，若在发酵过程中加入β-葡萄糖苷酶，则会与水解液发生反应，进而影响培养基碳源含量。因此，试验仅探究吐温-80、PEG-6000、木质素磺酸钠对枯草芽孢杆菌发酵的影响。

2.3.1 吐温-80 对发酵的影响

向发酵培养基中添加0～5 g/L的吐温-80，菌株具体生长情况如表2所示。由表2可知，添加0.5 g/L吐温-80，OD600从5.74提高到6.05，活菌数达到1.12×109CFU/mL。但随着吐温-80浓度持续增加，OD600和活菌数均不同程度降低，菌株生长受到抑制。这可能是因为较高浓度的吐温-80产生大量起泡使锥形瓶中溶氧量不足，影响菌株生长[24]。值得注意的是，菌株对葡萄糖利用情况的影响不大，说明枯草芽孢杆菌优先以葡萄糖作为碳源营养物质。

2.3.2 PEG-6000 对发酵的影响

培养基中添加0～5 g/L PEG-6000，枯草芽孢杆菌生长情况如表2所示。由表2可知，添加PEG-6000对杨木酶解液发酵具有抑制作用，随着PEG-6000浓度增加，抑制作用越强，PEG-6000浓度为5 g/L时，OD600降低到3.89，木糖消耗率仅有41.88%，活菌数为3.10×107CFU/mL，远低于空白样（8.42×108CFU/mL）。添加PEG-6000的发酵液渗透压增加，细胞液外渗，同时水解过程中产生的乙酸、糠醛等物质与表面活性剂作用，抑制菌株的生长[25]。试验结果与罗鹏[26]的研究报道有所差异，主要原因在于原料的化学组成和结构不同。

2.3.3 木质素磺酸钠对发酵的影响

木质素磺酸钠属于阴离子表面活性剂，负电性极强。向培养基中添加1 g/L和5 g/L木质素磺酸钠，枯草芽孢杆菌生长情况如表2所示。如表2可知，与吐温-80、PEG-6000作用效果不同，木质素磺酸钠对水解液发酵起促进作用，添加1 g/L木质素磺酸钠，OD600增加到6.79，活菌数最高，可达2.10×109CFU/mL，随着木质素磺酸钠剂量增加到5 g/L，活菌数略有下降，为9.62×108CFU/mL，但仍高于空白样。水解液发酵过程中木糖消耗明显更多，最高消耗率可达90.93%。综合对比3种表面活性剂可知，最好的酶解助剂是木质素磺酸钠，既可以提升酶水解效率，还可以促进枯草芽孢杆菌的发酵生产。