黄花草木樨苗期耐盐性综合评价

田小霞，毛培春，郑明利，孟 林

（北京市农林科学院草业花卉与景观生态研究所,北京 100097）

土壤盐渍化是世界上最重要和最广泛的环境问题之一[1]。目前，全球有超过800 万hm2的土地受盐渍化影响[2]，包括15%的干旱和半干旱土地，及40%的灌溉土地[3]。土壤盐渍化是造成土壤板结，限制植物生长的重要非生物胁迫之一，其影响渗透平衡，干扰植物新陈代谢进而直接破坏植物生长发育。近年来，由于过度放牧和水利工程的不合理建设，致使草地退化，盐碱化日渐严重[4-5]。采用耐盐牧草改良盐渍土不仅是目前减缓或防治土地盐渍化的主要研究热点，而且能够通过畜牧业生产获得经济效益。因此，筛选适宜盐碱地种植的牧草品种已成为生态文明建设、乡村振兴、草牧业持续发展的重要内容。

草木樨(Melilotus)是豆科一年生或二年生草本植物，原产于欧亚大陆和北非[6]，广泛分布于我国西北、东北和华北地区[7-8]。黄花草木樨(M.officinalis)和白花草木樨(M.albus)为该属最常见的栽培利用种[9]。黄花草木樨植株粗壮，主根发达，可以利用其他草本植物无法利用的土壤深层营养元素，富含蛋白质，具有较强的固氮能力，是重要的牧草绿肥植物，且适应多重土壤，包括盐碱土和盐渍土，但不耐酸性土壤[10]；耐瘠薄能力强于紫花苜蓿(Medicago sativa)和白花草木樨，具有同白花草木樨一样肥田沃土的功效[11-12]。目前关于黄花草木樨的研究主要集中于对氮素的矿化[13]、生物活性成分的检测[14-15]、应用其改良退化土壤和修复重金属土壤[16-17]等方面，这些研究对于黄花草木樨的开发及利用具有指导意义，但对黄花草木樨在盐碱地的种植不能提供科学支持。黄花草木樨种质资源是培育草木樨优质、高产的基础，然而不同的种质资源对盐的敏感性可能不同[18]。在耐盐植物育种工作中，温室耐盐种质材料的筛选是建立耐盐品种选择的第一步，且不同种质地区的植物材料其耐盐性也存在差异。因此，筛选耐盐性高的种质资源、确定合适的耐盐性测定指标，是利用黄花草木樨改良盐碱地的基础性工作。基于此，本试验以68 份黄花草木樨种质为试验材料，在温室条件下采用水培法模拟盐胁迫条件，通过测定其苗期生长和生理指标，应用多元统计分析方法，比较不同种质材料的耐盐性，综合评价方法和筛选指标可以应用于耐盐草木樨品种的选育实践工作。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为从俄罗斯瓦维洛夫植物研究所引进的68 份黄花草木樨种质材料，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供。材料编号分别为05-1042、05-1149、05-1198、09P-6011、09P-6021、09P-6045、05-1066、05-1093、09P-6051、09P-6074、09P-6125、10P-7589、05-1449、09P-5609、09P-5938、10P-7618、10P-7772、10P-7794、05-1207、05-1189、06P-2342、09P-5875、09P-5999、10P-7656、05-1428、06P-2398、09P-5828、10P-7676、10P-7684、10P-7742、05-1365、05-1406、05-1495、05-1333、10P-7804、05-1310、05-1286、05-1377、06P-2297、06P-2357、06P-2364、09P-5835、05-1137、05-1249、05-1275、06P-2276、06P-2386、06P-2436、10P-7883、11P-8390、11P-8479、11P-8490、11P-8499、11P-8510、10P-7837、10P-7911、10P-7945、11P-8505、08P-5329、08P-5363、08P-5455、11P-8401、08P-5479、11P-8513、11P-8429、07P-3544、07P-3624、08P-5410。

1.2 试验方法

1.2.1 材料培养与胁迫处理

种子发芽在25 ℃恒温培养箱中进行，设置白天光照时间16 h，光照强度选择3 000 lx。黄花草木樨种子经过筛选和消毒后，每100 粒种子播种至3 层滤纸的培养皿中，3 层滤纸每天浇10 mL 蒸馏水，重复4 次。黄花草木樨种子展开两片子叶后，移栽至水培容器中(长×宽×高=35 cm×27 cm×10.5 cm)，幼苗用薄海绵条包裹并固定在96 孔泡沫板上，每个水培盒移栽6 份样本，每份样本16 株；培养盒内装入Hoagland 营养液，每7 d 更换一次，每隔3 h 通气1 h。盐处理选用NaCl 溶液，设置NaCl 浓度为0、50、100、150、200 mmol·L-1，缓苗至三叶期时用相应浓度的NaCl 溶液代替Hoagland 营养液，重复3 次。每培养盒需NaCl 溶液9 L，7 d 更换一次处理溶液。pH在整个处理期间保持在5.8～6.0，处理14 d 后取样。

1.2.2 测定指标与方法

处理14 d 后记录存活植株数，并用于计算存活率；记录单株植株绿叶数(叶片绿色占整片叶2/3 以上为标准)；开始NaCl 处理时株高(H0)和实验结束时株高(H)使用直尺测定；叶绿素总含量采用直接浸提法；试验结束后蒸馏水清洗植株4～5 次，烘干至恒重，测定生物量。生长速率(cm·d-1)=(H-H0)/14；存活率=(试验结束后存活植株数/总株数)×100%。

1.3 数据处理与统计分析

1.3.1 单项指标耐盐系数ω

1.3.2 综合指标隶属函数值

式中：μ(Xj)表示第j个指标隶属函数值；Xj表示第j个指标值；Xmin表示第j个指标最小值；Xmax表示第j个指标最大值。

1.3.3 各综合指标的权重

式中：Wj表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度即权重；Vj表示经主成分分析所得各材料第j个综合指标的贡献率[18-19]。

1.3.4 耐盐综合评价值

式中：D为盐胁迫下综合指标评价所得耐盐性综合评价值。

应用Excel 2010 计算平均值，SPSS 19.0 进行相关分析、主成分分析、聚类分析和逐步回归分析。

2 结果与分析

2.1 各单项指标的耐盐系数及相关性分析

68 份黄花草木樨种质材料经NaCl 处理后，材料05-1406 (序号32)和09P-6125 (序号11)的植株干重(DW)和材料05-1286 (序号37)和10P-7589 (序号12)的单株绿叶数(NGL)耐盐系数大于1 (ω＞1)，即测定值均高于对照；其他种质材料的植株生长速率(GR)、叶绿素总含量(Chl)、苗高(SH)、存活率(SR)、植株干重和单株绿叶数的耐盐系数均小于1 (ω＜1)，即测定值均低于对照(表1)。

表1 NaCl 胁迫下68 份黄花草木樨种质材料生长和生理指标的耐盐系数(ω)Table 1 Salt tolerant coefficient (ω) of growth and physiological indices of 68 Melilotus officinalis germplasms under NaCl stress

NaCl 处理后，68 份种质材料中，指标生长速率耐盐系数最高的是材料09P-6125 (序号11)，为0.740；最低的是材料07P-3624 (序号67)，为0.303；叶绿素总含量中耐盐系数大于0.8 的材料有5 份，生长速率中耐盐系数没有高于0.8 的材料。生长速率、苗高、植株干重和单株绿叶数的耐盐系数分别在0.303～0.740、0.456～0.864、0.330～1.095、0.500～1.077，4 个指标中均没有耐盐系数值小于0.3 的材料。

对供试材料进行相关性分析(表略)，结果表明，68 份种质材料植株生长速率、叶绿素总含量、苗高、植株存活率、植株干重和单株绿叶数的耐盐系数间均呈极显著正相关(P＜0.01)。

2.2 不同指标耐盐系数的主成分分析

对68 份黄花草木樨6 项指标耐盐系数进行主成分分析(表2)，结果表明第1、第2、第3 主成分的贡献率分别为62.17%、12.56%和9.33%，累计贡献率84.07%，可代表6 项指标的大部分信息。此外，存活率、植株干重和苗高在第1 主成分代表信息中的特征向量是0.463、0.450 和0.412，表明存活率、植株干重和苗高在第1 主成分中作用较大；叶绿素总含量和植株干重在第2 主成分中的特征向量是0.936 和-0.239，表明叶绿素总含量和植株干重在第2 主成分中起主要作用。单株绿叶数在第3 主成分中的特征向量是0.768，表明单株绿叶数在第3 主成分中起主要作用。

表2 供试黄花草木樨种质苗期耐盐指标的主成分分析Table 2 Principal component analysis for salt tolerance indices at the seedling stage of the tested Melilotus officinalis germplasms

2.3 供试材料的耐盐性综合评价

根据各生长和生理指标耐盐系数和主成分分析结果综合指标的特征向量，计算得出NaCl 胁迫下68 份黄花草木樨种质材料的综合指标值CIx，依据公式(2)计算综合指标值的隶属函数值μ(x)，依据公式(3)计算出综合指标值的权重，最后依据公式(4)得出综合评价值D 值。根据D 值作为标准来评价各供试种质材料耐盐能力的大小，并对其进行排序(表3)。其中，排名前5 名的种质材料为09P-6125(序 号11)、10P-7589 (序 号12)、09P-5875 (序 号22)、09P-6074 (序号10)和05-1093 (序号8)，其D 值均在0.850 以上，D 值最高的09P-6125 (序号11)综合耐盐能力最强；低D 值种质材料为08P-5363 (序号60)、11P-8401 (序号62)、08P-5479 (序号63)、11P-8479(序 号51)和11P-8390 (序 号50)，D 值 均在0.200 以下，耐盐性相对较弱，种质材料08P-5363 (序号60)的D 值最低，说明其耐盐能力最弱。

表3 68 份黄花草木樨幼苗的综合指标值CIx、隶属函数值μ(x)、综合评价D 值及耐盐类型Table 3 Comprehensive index (CIx),subordinative function value [μ(x)],salt tolerance comprehensive valuation (D value),and salt tolerance of seedlings for the 68 Melilotus officinalis germplasms tested

续表 3Table 3 (Continued)

聚类分析可将68 份黄花草木樨分为4 种耐盐类型(图1)，第Ⅰ类为强耐盐型，总计6 份材料，包括09P-6125 (序号11)、10P-7589 (序号12)、09P-5875(序号22)等；第Ⅱ类为中耐盐型，总计20 份材料，包 括09P-6011 (序 号4)、09P-5828 (序 号27)、09P-6021 (序号5)等；第Ⅲ类为弱耐盐型，总计27 份材料，包括05-1042 (序号1)、09P-5609 (序号14)、09P-6045 (序号6)等；第Ⅳ类为敏盐型，总计15 份材料包 括11P-8401 (序 号62)、08P-5479 (序 号63)、11P-8479 (序号51)等。

图1 68 份黄花草木樨种质材料聚类树状图Figure 1 Dendrogram of clusters for 68 Melilotus officinalis accessions

2.4 回归模型建立及鉴定指标筛选

将68 份黄花草木樨各指标耐盐系数(ω)为自变量(X)，综合评价值D 值为因变量(Y)，应用逐步回归分析建立回归方程Y=-0.583+0.510XSR+0.551XChl+0.537XNGL(R2=0.955)，式中的存活率(XSR)、叶绿素总含量(XChl)和单株绿叶数(XNGL) 3 项指标对黄花草木樨耐盐性起显著作用，在试验条件相同时，可选择存活率、叶绿素总含量和单株绿叶数指标来测定其耐盐性。通过回归方程计算得出的预测值与D 值差值为-0.087～0.093，相关性分析表明，D 值与预测值存在极显著相关性(R2=0.977，P＜0.01)。

3 讨论

盐胁迫导致植物生长迟缓和生物量降低，而培育耐盐植物品种可以减轻盐胁迫对植物生长和生产的影响。研究表明，苗期是植物对盐胁迫最敏感的阶段[20-22]。因此，本研究选择了黄花草木樨的三叶期进行不同种质材料的耐盐性评价。盐胁迫下，不同种质材料的生长或者生理指标对盐胁迫的反应不同，用单一生长和生理指标来反映植株的耐盐性存在片面性。本研究结果表明，NaCl 处理后，68 份黄花草木樨种质材料的生长速率、叶片叶绿素含量、苗高、存活率4 个指标值均低于对照；植物干重和单株绿叶数指标中各只有2 份材料高于对照，其他种质材料干重和单株绿叶数均低于对照。相关性分析结果也表明，供试材料各指标间均呈极显著正相关，指标间信息存在重叠性，因此，本研究为消除指标间固有差异，选择了各指标耐盐系数的综合评价值来科学评价植株耐盐性[23-24]。

在植物耐盐性评价中使用多元统计方法，可以同时分析多个指标且计算得分并排序来提高评价的全面性，同时可以在不同的盐胁迫水平(例如中度和高盐水平)下对种质材料的耐盐性进行排序，提高耐盐性评价的准确性。本研究应用主成分分析法将多项指标转化成综合指标，结合隶属函数法求得相应的隶属函数值，进而结合各综合指标值的相对重要性进行加权求得综合评价值D 值，再者D 值是一个[0,1]闭区间上的纯数[19,25]，因而，根据D 值大小能科学有效地对68 份黄花草木樨种质材料的耐盐性进行准确评价。通过对综合评价值D值进行系统聚类分析，将68 份黄花草木樨种质材料划分为4 种类型，分为强耐盐型、中等耐盐型、弱耐盐型和敏盐型，其中强耐盐型材料6 份，中等耐盐型材料20 份，弱耐盐型材料27 份，敏盐型材料15 份。耐盐性强的黄花草木樨供试材料表现出较强的耐盐能力，在质量浓度150 mmol·L-1NaCl 处理下的苗高、幼苗存活率、绿叶数等与对照无显著差异；而敏盐型材料则出现盐害症状。采用综合评价方法，科学客观地从供试材料中筛选出耐盐性极强和耐盐性极弱的种质材料，可为进一步研究草木樨植物的耐盐机制及耐盐基因的挖掘提供科学依据。

本研究中，对D 值和耐盐系数进行逐步回归分析表明存活率、叶绿素含量和单株绿叶数3 个指标可较好地用于黄花草木樨的耐盐性评价，在同等试验条件下，可以利用这3 项指标预测其耐盐性。刘春华和张文淑[26]研究得出植株存活率可作为评价苜蓿品种耐盐性的指标。田小霞等[20]也指出植株存活率是评价紫花苜蓿耐盐性的重要指标。谢楠等[27]发现绿叶数是评价饲用小麦(Secale cereale)和小黑麦(Secale sylvestre)耐盐性的重要指标。张军等[28]指出叶绿素总含量是小麦苗期耐盐性评价的重要指标之一。本研究建立了水培系统的黄花草木樨耐盐性筛选方法，减少了田间耐盐性实验的不确定因素，加快了耐盐性评价进度，进而加快了黄花草木樨耐盐品种的育种速度。此外，我们建立了比较容易评价的表型特征，例如植株存活率、叶绿素含量和单株绿叶数等评价黄花草木樨耐盐性，不需要记录大量数据和成本，因此，可以比较简单快速地评价同等试验条件下植株的耐盐性。

黄花草木樨繁殖力强、抗旱、耐盐、防风固沙，能够固定大气中的氮，增加土壤腐殖质和氮素，改善土壤环境，改良贫瘠土壤，提高土地生产力等多种功能[29-30]，因此黄花草木樨可用于盐渍地的改良，但不同种质材料的耐盐性和对环境的适应性不同，因此实际人工栽植黄花草木樨时应根据种植区的水文和气候条件，选择适应当地环境且较耐盐的种质材料，以获得较高的生态、社会和环境效益。植物的耐盐性是多种性状相互作用的综合表现，同种植物不同种源甚至不同发育阶段其耐盐机制不同，因此，筛选可以应用于实际盐碱地改良的种质材料，还需要进行各个发育阶段的试验研究。

4 结论

通过对供试68 份黄花草木樨苗期生长速率、叶绿素总含量、苗高等6 个生长生理指标进行比较，依据单项指标的耐盐系数，进行相关性分析、主成分分析和综合评价值D 值，对供试种质材料的耐盐性进行了准确的筛选和排序；通过聚类分析，可将68 份种质材料分为强耐盐型、中等耐盐型、弱耐盐型和敏盐型4 类；通过对D 值和各单项指标逐步回归分析建立黄花草木樨种质材料耐盐性预测回归方 程Y=-0.583+0.510XSR+0.551XChl+0.537XNGL(R2=0.955)，可以较快且准确地对其耐盐性进行初步评价，在相同试验条件下，可通过测定存活率、叶绿素含量和单株绿叶数进行黄花草木樨种质材料耐盐性强弱的预测。