毫米波辐射对雄性小鼠生殖系统的影响

唐 正 魏金花 张 磊 翟 倩 袁建林 李 臻

1（中国人民解放军空军军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室 西安 710032）

2（中国人民解放军空军军医大学西京医院泌尿外科 西安 710032）

3（中国人民解放军空军军医大学西京医院空军军医大学妇产科 西安 710032）

随着科学技术的快速发展，现代社会信息化、电子化水平日益提高，各种电磁设备的使用密度和频率日渐增加，其中毫米波（Millimeter wave，MMW）属非电离辐射中的极高频波，波长为1～10 mm，频率在30～300 GHz［1］，其分辨率高，抗干扰性好，测速灵敏度高，在雷达、通讯、无线电测量等方面得到普遍应用［2］。随着毫米波的广泛应用，公众在生活与工作环境中与毫米波的接触逐渐增多，其安全性问题引起人们关注。在内脏器官中，睾丸处于表浅部位，是电磁辐射较敏感的靶器官之一。已有研究表明低频微波辐射可对雄性生殖系统造成损伤［3-5］，而毫米波辐射作用下的雄性生殖损伤效应尚无报道。

本研究为掌握毫米波辐射对男性生殖健康的危害特点，明确其对男性生殖和生精潜能的影响，通过建立毫米波辐射小鼠模型，探究长期辐照下的累积损伤效应，为早期诊断和防治毫米波所致男性不育提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1试剂

苏木精（睿思科生物技术有限公司）；伊红（上海碧云天生物技术有限公司）；DAPI 细胞核染色液（北京博奥森生物技术有限公司）；TUNEL凋亡检测试剂盒（Roche，Swiss）；伊文思蓝（Biofer，USA）；M 2培养基（Millipore，USA）。

1.1.2仪器

Kα 频段微波辐射系统（西安电子工程研究所）；EMUC7 超薄切片机（Leica，Germany）；光学显微镜（Olympus，Japan）；荧光显微镜（Zeiss，Germany）；计算机辅助精子分析仪CASA（赛司医疗科技有限公司）。

1.2 动物分组与辐照条件

实验动物选用8周龄雄性BALB/c小鼠120只，购自空军军医大学实验动物中心，实验经空军军医大学动物伦理中心批准进行，按照辐照时间（1周、2 周、3 周、4 周、5 周、6 周、7 周、8 周、9周）分为9 组。其中1～3 周，每组8 只；4～9 周，每组16 只；各组小鼠再平均随机分为辐照组（MMW）和假辐照组（Sham）。所有小鼠均诱导进入树脂材料（仪器测试无阻挡）小笼中，使其无法自由活动，笼身布满小孔以保证透气。辐照组放置于离辐照源10 cm 处（经测功率密度为10 mW/cm2），辐照方向正对于小鼠尾部，辐照时间为2 h/d，持续9 周；Sham 组在装笼后放置于相同位置，辐射仪器不开机。所有小鼠在辐照前会进行2 周的装笼习服，在对应周数辐照完成4 h 内处理并进行检测。辐照组与Sham组小鼠辐照前后经红外线测温仪测量阴囊温度无差异，波动于35.7～36.2 ℃。

Kα频段微波辐射系统由信号源及射频放大器、辐射天线、馈线系统组成（图1）。波源参数：脉冲波，峰值功率是18.6 W，占空比10%，脉宽100 μs，重复频率1 000 Hz，频率为34.5 GHz，信号波长为8.69 mm；接收天线增益为25 dB。

图1 Kα频段微波辐射系统示意图（a）和毫米波辐射现场照片（b）Fig.1 Schematic diagram of Kα frequency band microwave radiation system(a)and millimeter wave radiation field photo(b)

1.3 检测方法

1.3.1苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining，HE)

小鼠睾丸分离出后置于Bouin氏液中固定，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片，切片经二甲苯脱蜡，酒精脱水后进行HE染色，在光学显微镜下观察拍片。随机选取每个样本的12 个视野，测量并统计生精小管的的直径，同时通过Johnsen 评分［6］统计损伤程度。

1.3.2TUNEL染色

石蜡切片常规脱蜡、脱水后，按照TUNEL 凋亡检测试剂盒说明书的操作步骤进行染色，在荧光显微镜下观察结果，并随机选择每个样本的12个视野，统计凋亡生精小管所占比例以及凋亡生精小管中凋亡细胞数量。

1.3.3伊文思蓝（Evans blue，EB）注射观察血睾屏障

将小鼠用戊巴比妥钠进行麻醉后，从尾静脉注射0.2%EB 0.15 mL，30 min 后通过心脏注射磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS）至流出无色液体，取出睾丸进行冰冻切片，切下的片子立刻在荧光显微镜下观察。

1.3.4精子数量、畸形率及活力检测

小鼠处死后取出附睾，剔除多余脂肪，截取附睾尾部，用小刀划几个小口，放于M 2胚胎培养基中，轻轻晃动2 min，在37 ℃下孵育20 min，用100 μm 孔径的细胞筛将精子悬液过滤，在计算机辅助精子分析仪（CASA）下进行分析。

1.4 统计学分析

使用IBM SPSS statistics 20 软件对实验数据进行统计分析，两组数据之间采用完全随机设计两独立样本t检验，多组之间比较应用方差分析，p＜0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 毫米波辐射对小鼠睾丸形态的影响

HE 染色结果如图2 所示。由图2 可知，辐照1～4 周，MMW 组与Sham 组相比睾丸形态无明显差异，辐照第5 周，MMW 组出现生精上皮脱落，第6 周可见不同程度的管腔扩大，第7 周、8 周生精细胞排列紊乱，生精细胞数量减少，空泡形成，第9周管腔内无精子，有大量空泡。生精小管直径及Johnsen评分显示，前4 周MMW组与Sham组相比Johnsen 评分无明显差异，从第5 周开始MMW组较Sham组明显下降，第9周下降最显著，如图2（b）、（c）所示。结果表明长期辐照下的睾丸损伤从第5周开始，随着辐照时间的增加，损伤加重。

图2（a）辐照1～9周后小鼠睾丸形态的变化；（b）辐照1～9周后生精小管直径；（c）辐照1～9周后Johnsen评分（n=5，与Sham组相比，*p＜0.05，**p＜0.01）Fig.2 (a)The changes of testicular morphology after 1～9 weeks of irradiation;(b)the diameter of seminiferous tubules after 1～9 weeks of irradiation;(c)the Johnsen score after 1～9 weeks of irradiation(n=5,compared with the Sham group,*p＜0.05,**p＜0.01)

2.2 毫米波辐射对小鼠生精细胞凋亡的影响

TUNEL染色显示前4周MMW组与Sham组凋亡细胞均无显著增加，从第5周开始，MMW组睾丸生精细胞凋亡较Sham 组明显增加，如图3（a）所示；统计数据显示，与Sham 组相比，MMW 组凋亡阳性管腔数量从第5周开始增加，随着辐照时间的延长，凋亡阳性管腔数量逐渐增加，第9周凋亡阳性管腔数量显著增加，如图3（b）所示；统计每个凋亡阳性管腔中的凋亡细胞数量，结果显示，从第5周开始MMW组较Sham组增加，至第9周凋亡细胞明显增加，如图3（c）所示。通过TUNEL 染色结果可以看出，毫米波引起的睾丸生精细胞凋亡从第5 周开始，随着辐照时间的延长，凋亡随之加重，第9周时凋亡细胞明显增多，其规律与形态变化基本一致。

图3（a）MMW组与Sham组睾丸细胞TUNEL染色结果；（b）辐照4～9周后，两组凋亡管腔占所有管腔的百分比；（c）辐照4～9周后，平均每个凋亡管腔中凋亡细胞数量（n=5，与Sham组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）Fig.3 (a)TUNEL staining of testis cells in MMW group and Sham group；(b)the percentage of apoptotic lumen in all lumen in two groups after 4～9 week exposure；(c)the average number of apoptotic cells per apoptotic lumen after 4～9 week exposure(n=5,compared with the Sham group,*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001)

2.3 毫米波辐射对小鼠血睾屏障的影响

鼠尾静脉注射伊文思蓝后观察血睾屏障（BTB），结果如图4 所示。由图4 可知，从第5 周开始，可观察到伊文思蓝渗透到生精小管中，往后各周均可观察到此现象，且辐照第9周较其他周更为明显。

图4 毫米波辐照4～9周后小鼠血睾屏障变化Fig.4 Changes of blood-testis barrier in mice after 4～9 week millimeter wave radiation

2.4 毫米波辐射对小鼠精子数量及活力的影响

提取附睾精子后通过CASA分析，结果如图5所示。由图5可知，与Sham组相比，MMW组第9周精子数量明显下降，精子畸形率在5～9周明显升高，且随着照射时间的增长，畸形率升高程度显著。总活力（图6（a））及前向运动率（图6（b））从辐照第7 周开始较Sham 组明显降低，往后各周均有统计学差异。

图5（a）辐照4～9周后小鼠精子数量的变化；（b）精子畸形率的变化（n=5，与Sham组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）Fig.5 (a)Changes of sperm count of mice after 4～9 weeks of irradiation;(b)changes of sperm deformity rate(n=5,compared with the Sham group,*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001)

图6（a）辐照4～9周后小鼠精子总活力的变化；（b）辐照4～9周后小鼠精子前向运动力的变化（n=5，与Sham组相比，*p＜0.05）Fig.6 (a)Changes of the total sperm motility of mice after 4～9 week exposure；(b)changes of forward motility of mice sperm after 4～9 week exposure(n=5,compared with the Sham group,*p＜0.05)

3 讨论

近年来，毫米波器件性能的不断提高促进了毫米波在各个领域的应用。目前，基于毫米波频段的应用主要体现在毫米波通信、毫米波成像及毫米波雷达等方面［2］，民众及作业人员暴露于毫米波辐射的风险也大大增加。由于毫米波的波长短、频率高、穿透能力差［7］，当前关于毫米波生物效应的研究主要集中于生物体表浅部位［8］，如皮肤、角膜等体表较浅的器官［9-12］，但也有研究发现，毫米波可对内脏器官产生影响［13］，且主要研究短期热效应对生物体的损伤。而在实际情况中，毫米波作业人员会在长时间内受到多次低剂量辐照，其在作业人员体内是否有累积效应目前尚不清楚。长时程、低剂量毫米波的生物效应、损伤机制及保护策略的研究是电磁生物学领域亟需解决的重要问题，而毫米波对雄性生殖系统是否有损害至今未知。本研究聚焦于持续毫米波辐射对小鼠雄性生殖系统的影响，并展开相关研究。目前认为微波辐射功率密度大于10 mW/cm2主要产生的生物学效应为热效应［14］。本研究采用10 mW/cm2的功率密度，同时排除热效应对小鼠的损伤，探究非热效应最大功率密度参数下对小鼠生殖系统的影响，根据目前已知文献，探究长期微波辐射效应的实验多采用2 h/d，持续1～2月的时间［4-5,15］。本研究采用相对时间较长的方式对小鼠雄性生殖器官部位进行局部照射。结果表明：在10 mW/cm2剂量下，长时间暴露于毫米波辐射将直接损害小鼠的睾丸及生殖潜能，且发现辐照时间对小鼠生殖系统损伤具有累积效应。

本研究首先通过HE 染色观察辐照1～9 周后每周小鼠睾丸形态变化，发现在连续辐照第5周时开始出现睾丸形态的变化，通过生精小管直径及Johnsen 评分评估形态的损害。结果显示，5～9 周的睾丸形态的损伤程度MMW 组较Sham 组有明显差异，且辐照第9周损伤最显著，说明毫米波辐射只有累积到一定程度时才会产生损伤，且会随着辐照时间的增加产生累积效应。结果表明，持续5周毫米波辐照是雄性小鼠生殖系统损伤的阈值，因此着重对4～9周的损伤效应进行验证。

基于HE 结果，我们进一步通过TUNEL 染色方法对MMW 组及Sham 组小鼠睾丸生精细胞凋亡水平进行检测，发现从辐照第5周开始，生精细胞凋亡率MMW 组较Sham 组升高，统计4～9 周凋亡数量的变化，发现凋亡管腔占所有管腔的百分比和平均每个凋亡管腔中凋亡细胞的数量均随着照射时间的延长而增加。细胞凋亡是由于外界刺激触发细胞内程序性死亡而引发细胞自杀的过程，睾丸中生精细胞自发性退化通过细胞凋亡发生［16］，国内外研究表明，微波辐照可引起睾丸细胞的凋亡［15,17-19］，也有研究证明，微波辐照可以持续时间依赖性的方式增加凋亡严重程度［5］。本研究证明高频率的毫米波辐照可引起睾丸生精细胞凋亡，且具有累积效应，其具体机制需要进一步探究。

为进一步明确生殖损伤的原因，我们通过EB尾静脉注射方法观察毫米波辐照后BTB 的变化。在辐照第5 周时，辐照组可观察到EB 在管腔内沉积，至第9 周时可观察大量EB 在管腔内沉积。BTB 是睾丸中血管和曲细精管之间的物理屏障，由曲细精管支持细胞之间的紧密连接形成，本研究发现毫米波辐照会破坏血睾屏障，影响生精细胞发育。但本实验中发现辐照后5～8周血睾屏障损伤无明显加重现象，损伤累积效应不明显，这可能与支持细胞有关。支持细胞间所形成的紧密连接，是构成BTB 的形态学基础，支持细胞对各种刺激有较大的耐受性，一般不易遭到破坏，说明实验中所用的毫米波参数尚不能引起血睾屏障的严重损害。

CASA分析显示，精子数量在辐照前8周均无明显差异性，辐照第9周可观察到辐照组精子数量较Sham组明显下降；精子活力检测结果表明，在辐照7～9 周时精子活力较Sham 组明显下降。考虑这种结果也可能与毫米波辐照的累积效应有关，只有当辐照累计到一定程度时，才会引起精子数量及活力的变化。目前研究表明微波辐射具有累积效应［4-5，20-21］，但关于毫米波的累积效应尚不清楚，长时间的毫米波暴露产生的生物效应是值得关注的问题。本研究虽证明毫米波辐射可引起睾丸形态和功能学的改变，且具有累积效应，但由于吸收剂量和频率单一，没有探讨不同频率、不同功能密度下的变化，还需要进一步探究在不同参数下的损伤效应。同时毫米波损伤的具体机制仍不清楚，未来应将转录组学、蛋白质组学应用于研究中，发现新的损伤机制及对损伤机制的信号通路进行深入研究。

本研究发现，在每天辐照2 h，持续5 周的情况下，毫米波辐射可引起雄性小鼠生殖损伤，并且损伤效应与辐照时间存在量效关系。根据此结果推测，短期低剂量的毫米波辐射相对安全，但对于长时间作业人员，毫米波可能对男性生殖造成危害，且有累积效应，应加强作业人员的防护。本研究评估了34.5 GHz 毫米波辐射导致生殖损伤情况，对了解毫米波损伤的生物效应和机理有一定的参考价值。

作者贡献说明唐正实施研究过程、采集整理数据、统计分析、文章撰写；魏金花指导实验过程、修改文章；张磊和翟倩技术和材料支持；袁建林获取研究经费、指导性支持；李臻获取研究经费、提出研究思路、设计研究方案及修改文章。