平板计数法测定果酒中菌落总数的不确定度分析

张潇月

摘 要：为了提高实验室检测结果的准确度，本文结合食品微生物检验菌落总数测定的最新标准与评定测量不确定度的相关规定要求，分析果酒中菌落总数不确定度的来源，采用合并样本标准差的方法来评定菌落总数的不确定度。结果建立了果酒中菌落总数的不确定度评定方法，测量不确定的扩展不确定度为0.079 3。

关键词：菌落总数;不确定度;果酒

Uncertainty Analysis of Total Number of Colonies in Fruit Wine by Plate Counting Method

ZHANG Xiaoyue

（Wuliangye Group Co.， Ltd.， Yibin 644007， China）

Abstract： In order to improve the accuracy of laboratory test results， the latest standards for total bacterial count determination of food microbiological test and related requirements for evaluation of measurement uncertainty was combined in this paper， the source of total uncertainty of bacteria in fruit wine was analyzed and the method of uniting standard deviation was applied to determine the uncertainty of the colony. The results showed that the method was established to evaluate the uncertainty of total number of bacteria in fruit wine， and the extended uncertainty of measurement uncertainty was 0.0793.

Keywords： total number of colonies; uncertainty; fruitwine

随着实验室认可和资质认定工作的开展[1]，根据《General Requirements for the Competence of Testing and Calibration Laboratories》（IS0/IEC 17025：2017）中相关规定[2]，测量不确定度评定是检验检测实验室必备的能力之一，因此越来越多的实验室意识到测量不确定度评定的重要性[3]，在实验室的日常检测中，积极开展方法不确定度评定工作。但不确定度在微生物检验工作中应用较少。本文对果酒中菌落总数计数检验结果进行不确定度评定[4]。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

CICC10389大肠埃希氏菌、CICC10293产气肠杆菌和CICC10384金黄色葡萄球菌，中国工业微生物菌株保藏管理中心;平板计数琼脂，北京陆桥技术股份有限公司;培养箱，上海一恒科学仪器有限公司;电子天平，奥豪斯（上海）有限公司。

1.2 试验方法

试验参考《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》（GB 4789.2—2016）[5]、《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）。

1.3 样品制备

3种标准菌株混合培养24 h，取新鲜的混合液培养物于灭菌的0.85%的生理盐水中，制作成0.5麦氏浓度的溶液，然后稀释10倍制成约为1×105 CFU/mL的菌悬液。取上述菌悬液1 mL加入500 mL已灭菌的果酒中，充分混匀作为样品检测原液。用25 mL的大肚吸管分别吸取25 mL样品检测原液，放入

10支已滅菌的放有玻璃珠的500 mL的三角瓶中。

1.4 测量过程

1.4.1 稀释样品

以无菌操作将检样25 mL放入含有225 mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），经过充分振摇成1∶10的均匀稀释液。用1 mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液

1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，混合均匀，做成1∶100的稀释液。每递增稀释1次，即换用1支灭菌吸管。

1.4.2 选择稀释倍数

选择2～3个适宜稀释度。本实验室选取10-1、10-2两个稀释度。分别在做10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管吸取1 mL稀释液于灭菌培养皿内，每个稀释度做2个培养皿。

1.4.3 倾倒培养基

稀释液移入培养皿后，应及时将冷却至46 ℃左右的营养琼脂培养基注入培养皿，每皿约注入

15 mL，并转动培养皿使之混合均匀，同时将平板计数琼脂倾入加有1 mL稀释液的灭菌培养皿内作空白对照。

1.4.4 培养及计数

待营养琼脂凝固后，翻转平板，置（36±1）℃生化培养箱内培养（48±2）h，进行计数，选取菌落数在30～300的平板，计算平均数。

2 结果与分析

2.1 不确定度的来源

样品称量引入不确定度及样品稀释引入的不确定为A类;重复性引入的不确定度为B类，不确定度具体来源见图1。

2.2 不确定度评定

2.2.1 取样引入的不确定度

用500 mL的量筒量取225 mL的0.85%的生理盐水，加入到已装有25 mL的样品原液的500 mL的三角瓶中。根据JJG 196—2006常用玻璃仪器规定，500 mL量筒容量允许误差为±2.5 mL，假定其为矩形分布，则标准不确定度和相对标准不确定度分别为：u（V1）==1.443 4;urel（V1）==0.006 4。

2.2.2 样品稀释过程中引入的不确定度

样品以10倍梯度稀释是通过1 mL加样到

9 mL的稀释液中进行的，根据JJG 196—2006常用玻璃仪器规定，1 mL刻度吸管的容量允许误差为±0.015 mL，假定其为矩形分布，则标准不确定度为u（V2）==0.008 7，其相对不确定度为urel（V2）==0.008 7。根据JJG 196—2006常用玻璃仪器规定，10 mL刻度吸管容量允许误差为±0.1 mL，其标准不确定度为u（V3）==0.057 7;其相对不确定度为urel（V3）==0.005 77。

2.2.3 重复性引入的不确定度

对同一个样品的10份样品原液，按照《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》

（GB 4789.2—2016）进行检测，检测结果见表1。由于微生物检测数据相差很大，不能直接进行统计，对数据进行对数处理见表1。根据表1，利用下面计算公式计算出重复性引入的不确定度为

u（X）==0.021 8，样品的相对不确定度为urel（X）==0.009 8。

2.3 合成不确定度

2.3.1 相对合成标准不确定度为：

Urel==0.015 7，合成不确定度为U菌落=Urel=0.015 7×2.235 5=

0.035 1

2.3.2 计算扩展不确定度

取95%的置信水平，自由度为9，查t分布表得K=2.26，则扩展不确定度为：

U=K×U菌落=2.26×0.035 1=0.079 3。

当检测结果以平均值表示时，其取值区间分布于±0.079 3。

3 结论

以第1个测试样品为例，测定结果的对数值为2.204 1，其取值区间在2.204 1±0.079 3，取反对数的样品的取值区间为133～192 CFU/mL，基于本次测量方法所得到的不确定度，第一样品菌落总数测定结果可估算为133～190 CFU/mL。由于微生物检测中，检验结果的分散性较大，不属于正态分布，检验结果必须转化成对数形式，使其接近正态分布，便于建立数学模型进行计算。

参考文献

[1]中国合格评定认可国家委员会.测量不确定度要求的实施指南：CNAS-GL05—2011[S].北京：中国标准出版社，2011.

[2]国际标准化组织.测试和校准实验室能力的通用要求：ISO/IEC17025—2005[S].北京：中国标准出版社，2005.

[3]中華人民共和国国家质量监督检验检疫总局.测量不确定度评定与表示：JJF 1059.1—2012[S].北京：中国标准出版社，2012.

[4]张凤桐.食品卫生微生物学检验菌落总数测定方法的效果分析[J].中国保健营养，2020，30（25）：357.

[5]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定：GB 4789.2—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.