氟西汀联合毛蕊花糖苷改善抑郁症大鼠抑郁行为、学习记忆能力和上调CREB水平

韩 涵 韩 健 曹 蕾

（解放军总医院京中医疗区，北京 100820）

抑郁症患者随着社会环境压力的增大而不断增多，趋于年轻化。环境、遗传、性格、合并其他疾病等均可导致抑郁症的形成[1]。抑郁症病因无法完全明确，亦无特定发病机制，目前尚无标准的治疗方案，因此，治疗的发展也受到阻碍[2]。研究表明抑郁症与信号转导通路、转录因子的调节有关。环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）的表达可提高情绪、学习记忆、海马神经元突触传递等[3]。药物干预、心理辅导、物理治疗是该病常用治疗方式。而药物为主要治疗方法，抑郁症患者通过谨遵医嘱服用药物专业治疗可有痊愈机会[4]。氟西汀是一种用于心理治疗的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（serotonin reuptake inhibitor，SSRI），可用于治疗抑郁症、强迫症、神经性贪食症。氟西汀可上调突触神经末梢与下膜间隙的5-羟色胺，调节患者焦虑与抑郁。也有研究表明，氟西汀可保护神经、抗凋亡、抗肿瘤、消炎[5]。毛蕊花糖苷（acteoside，Act）别称麦角甾苷，为桂花提取物，生物活性很强，可增强记忆力、抗衰、抗炎[6]。研究表明[7]受损的中枢神经可通过毛蕊花糖苷起到一定的保护作用，目前临床未见有关毛蕊花糖苷对抑郁症的疗效方面的研究。本实验采用慢性不可预见性温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）结合孤养方式制备抑郁大鼠模型，研究氟西汀联合毛蕊花糖苷对抑郁症大鼠中CREB 的表达和学习记忆能力的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

雄性SD 大鼠45 只，7～9 周龄，体质量170～200 g，购于武汉云克隆动物公司，合格证编号为SCXK（鄂）20120011，常规饲养，正常饮水、觅食，温度（23±1） ℃，湿度40%～50%。饲养7 d 后开始制备抑郁大鼠模型。45 只大鼠采用乱数表法分为正常组（对照组）、抑郁症组（模型组）、氟西汀组、毛蕊花糖苷组（Act 组）、氟西汀联合毛蕊花糖苷组（联合组），每组各9 只。

1.2 实验试剂与仪器

水迷宫实验系统购于上海研匠生物有限公司；激光共聚焦显微镜购自广州明媚电技术有限公司；Noldus 动物运动轨迹追踪系统购于上海软隆科技发展有限公司；Phomo 酶标仪购于济南欧莱博技术有限公司；盐酸氟西汀购于西安迪赛生物药业有限公司；毛蕊花糖苷购于上海甄准生物有限公司；蔗糖购于福建药典实验科技有限公司；CREB抗体购于深圳市豪地华拓生物科技有限公司；兔抗鼠抗体购于武汉戴安生物技术有限公司；TBS缓冲液（BOSTER）购于基因科技（上海）股份有限公司。

1.3 抑郁大鼠模型建立

CUMS 结合孤养方式于4 周内制备抑郁大鼠模型[8]。除正常组不给予CUMS 外，其他组给予CUMS 包含强迫24 h 无睡眠、夹尾2 min、断食24 h、断水24 h、潮湿环境24 h、冰水游泳与热水游泳各6 min、摇晃5 min 等，制备期内每天1 种刺激方式，2 d 内刺激方式应不同。旷场实验与糖水喜好实验显示P＜0.05 时代表抑郁模型建立成功；若未达到模型建立成功标准，重复采取以上刺激方式进行干预。

1.4 给药

模型建立同时，固定时间给药，每天上午10：00 药物干预1 次。氟西汀组：30 mg/ kg 氟西汀溶于4 mL NaCl 溶液中灌胃；Act 组：30 mg/kg 毛蕊花糖苷溶于4 mL 氯化钠溶液中灌胃；联合组：30 mg/kg 氟西汀联合30 mg/kg 毛蕊花糖苷溶于4 mL NaCl 溶液中灌胃；对照组及模型组在相同时间采用同体积剂量NaCl 溶液进行灌胃。连续给药28 d 后采取行为学实验。

1.5 旷场实验

正式实验前1 d 和干预后28 d 时，将大鼠放进120 cm×90 cm×60 cm 无木盖方箱中，通过Noldus 动物运动轨迹系统观察大鼠6 min 内的站立次数与活动距离，并进行记录，以观察大鼠在新环境下的自主探究行为[9]。

1.6 糖水偏好实验

正式实验前1 d和干预后28 d时，将2瓶250 mL 1%蔗糖溶液放于笼子中，24 h 后于笼中放置同等含量的纯水和1%蔗糖溶液（均为250 mL），2 h 后观察，并计算出大鼠的糖水喜爱量[10]。

1.7 水迷宫测试

造模成功后，进行正式实验。在水迷宫中加入白色试剂，使水变为不透明白色，隐藏平台，水温25 ℃，周围环境条件保持安静、稳定。实验历时4 d，将大鼠放入水池，100 s 后若大鼠在水迷宫内迷失，将其牵引到平台，观察15 s，100 s 为大鼠潜伏期[11]。

1.8 平衡木测试

造模成功后，进行正式实验。在给药1、8、15、28 d时，进行平衡木测试，测试当天将大鼠提前1 h带入房间适应环境平衡木，圆柱状长竿，长2.5 m、直径3 cm。平衡木两端各放置一塑料平台用作大鼠起、终点缓台，规格（15 cm×15 cm×8 cm）。缓台及平衡木距地面高度0.9 m，地面均铺上软垫，以防大鼠摔伤。观察并记录大鼠穿过平衡木的时间[12]。

1.9 免疫印迹检测CREB 的蛋白表达

麻醉大鼠进行脑组织剥离，获取海马组织，提取蛋白，常温封闭1 h 后，TBSS 漂洗，滴入一抗37℃孵育2 h，第2 次TBST 洗掉结合的抗体后，滴入二抗25 ℃孵育1.5 h 左右后，再次洗膜，ECL 显色，GAPDH 为内参，结合条带的灰度值进行计算，并做统计分析。

1.10 统计学处理

釆用SPSS 22.0 软件与GraphPad Prism 5.0 软件对数据行统计学分析。计量资料以±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 旷场实验结果

旷场实验结果显示，1 d 时，对照组、模型组、氟西汀组、Act 组、联合组，5 组间无明显差异（P＞0.05）；28 d 时，模型组、氟西汀组、Act 组、联合组旷场实验水平活动距离、站立次数均低于对照组，药物干预后，氟西汀组、Act 组、联合组水平活动、站立次数明显高于模型组。同时，联合组高于氟西汀组、Act 组，组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

图1 各组大鼠水平活动距离对比.

图2 各组大鼠站立次数对比.

2.2 糖水偏好结果

糖水偏好结果显示，1 d 时，对照组、模型组、氟西汀组、Act 组、联合组比较无差异（P＞0.05）；28 d 时，对照组糖水偏好高于其他各组（P＜0.05），药物干预后，氟西汀组、联合组糖水偏好明显高于模型组，且联合组大鼠糖水偏好高于氟西汀组、Act 组，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图3 各组糖水偏好对比

2.3 水迷宫测试结果

1 d 时，对照组、模型组、氟西汀组、Act 组、联合组大鼠逃避潜伏期比较无差异（P＞0.05）。与对照组相比，其他各组大鼠8 d、15 d、24 d 的逃避潜伏期延长（P＜0.05）；与模型组相比，氟西汀组、Act 组和联合组大鼠实验8 d 开始时逃避潜伏期时间减少，均低于模型组（P＜0.05），且联合组大鼠逃避潜伏期低于氟西汀组、Act 组（P＜0.05）（图4）。

图4 各组大鼠逃避潜伏期对比

2.4 平衡木测试结果

1 d 时，5 组大鼠通过平衡木时间相比无显著差异（P＜0.05）。其余时间点，模型组、氟西汀组、Act 组、联合组大鼠通过平衡木时间高于对照组（P＜0.05），氟西汀组、Act 组、联合组低于模型组（P＜0.05），且联合组大鼠低于氟西汀组、Act组（P＜0.05）（图5）。

图5 各组大鼠平衡木测试对比

2.5 大鼠海马区CREB 蛋白表达结果

免疫印迹实验结果显示，海马区的CREB 蛋白表达的相对值如下：模型组0.191±0.038、氟西汀组0.229±0.081、Act 组0.210±0.077、联合组0.416±0.085、对照组0.699±0.072。对照组大鼠海马区CREB 蛋白表达高于其他各组。氟西汀组、Act 组、联合组的海马区CREB 蛋白表达均高于模型组，低于对照组，同时联合组CREB 蛋白表达高于氟西汀组、Act 组（P＜0.05）（图6）。

图6 各组大鼠海马区CREB 蛋白表达检测对比

3 讨论

抑郁症属于精神疾病，近年来确诊的患者逐年增多。造成抑郁症患者精神损伤因素主要有长期的精神压力、周围环境、性格、遗传等（应激事件）[13]。抑郁症表现为持续的快感缺失、情绪低沉、紧张焦虑、社交恐惧和认知功能障碍等[14]。

抑郁动物模型采用CUMS 结合孤养建立，其中学习记忆等能力在人或动物长期处于CUMS 时会受到明显的影响[15]，该症状与临床抑郁症患者基本相似。本实验中模型组大鼠在旷场实验中的运动轨迹明显少于对照组，并对糖水的偏好明显降低；水迷宫测试和平衡木测试中模型组均低于对照组，表明大鼠学习记忆能力降低，显示抑郁大鼠制备成功。本研究结果显示，氟西汀组、Act 组、联合组大鼠旷场实验、糖水偏好、水迷宫测试及平衡木测试结果均优于模型组，且联合组效果最为显著，表明氟西汀联合毛蕊花糖苷对改善抑郁大鼠症状，提高学习记忆能力方面有重要作用。邓海峰[6]等研究发现毛蕊花糖苷可使抑郁大鼠的学习记忆能力提高，其原理是它会使海马突触可塑性和Syt1 的表达上调；研究也显示氟西汀在对CUMS 影响导致的学习记忆能力下降等方面也有较大改善[16]，本文研究结果与以上研究结果基本一致。氟西汀是一种治疗抑郁的药品，它是一种5-羟色胺再摄取的选择性抑制剂[17]。毛蕊花糖苷有抗衰、调节免疫力、增强记忆力、抗炎、抗肿瘤等作用[18]，可以通过提高中枢乙酰胆碱能神经元功能、上调神经生长因子表达等途径改善D-半乳糖导致的脑损伤，增强中枢神经系统 功能[19]。以上2 种药物作用机制表明可提高学习能力与记忆力。

本实验有关CREB 研究结果显示，模型组、氟西汀组、Act 组、联合组CREB 蛋白表达水平均低于对照组，经过药物干预后氟西汀组、Act 组、联合组CREB 蛋白表达水平高于模型组，且联合组效果最为显著，表明氟西汀联合毛蕊花糖苷可使CREB 蛋白表达上调。孔令韬[20]等研究发现抑郁症大鼠模型海马组织中CREB 表达低于正常组，给予氟西汀干预后，其CREB 表达高于模型组，表明氟西汀可激活大鼠海马组织中CREB 蛋白的活性，对于改善抑郁症效果较为明显。本研究结果与以上研究结果相似。CREB 为重要核转录因子之一，抑郁症的病理过程与CREB 之间存在极大关联，脑内海马可转导应激反应；海马CREBb 表达下调，可使海马神经萎缩、神经回路突触传递功能变弱、学习记忆功能受到影响[3]。氟西汀联合毛蕊花糖苷治疗会使抑郁症患者CREB 表达水平上调，长时间使用可改善抑郁行为。有学者研究发现，抗抑郁药物可提高模型大鼠海马区的CREB 表达及活性[1]。刘柳等[21]在抑郁症患者尸体解剖中显示，进行药物治疗的患者CREB 的水平高于未进行治疗的患者。而氟西汀、毛蕊花糖苷等药物可以激活CREB，调节相关基因转录，影响细胞因子的表达、神经细胞的再生及存活。以上研究表明功能蛋白CREB 在抑郁症的机制研究中起到重要作用。

综上所述，氟西汀联合毛蕊花糖苷可以改善抑郁模型大鼠的抑郁症状，提高抑郁症大鼠海马CREB 表达水平及学习记忆能力。