荞麦七水提物通过调控LncRNA SOX21-AS1/miR-451a通路抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的机制

李治国 王花花 袁媛 柳淼 常欢

(焦作市人民医院消化科，河南 焦作 454000)

胃癌是全球第五大常见恶性肿瘤，也是导致癌症相关死亡的第三大原因，2018年约有100万新发病例，有78.3万死亡病例，男性的发病率是女性的2倍〔1〕。尽管近年来包括手术、化疗、放疗和靶向治疗在内的多模式治疗有所改善，但晚期胃癌患者的预后仍面临着挑战。因此，迫切需要阐明胃癌潜在的调控网络，探寻新的治疗策略，提高患者的生活质量。荞麦七为蓼科植物翼蓼Pteroxygonum giraldii Damme et diels的干燥块根，属秦岭“七药”之一，具凉血止血、除湿解毒之功，用于痢疾、崩漏、疔疮、狂犬咬伤等的治疗〔2〕。研究表明，荞麦七水提物对肺癌、乳腺癌细胞的增殖具有抑制作用〔3,4〕。然而荞麦七水提物对胃癌细胞的毒性作用及其机制尚未可知。长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的转录物，在多种癌症中异常表达〔5〕。LncRNA SOX21反义RNA1(SOX21-AS1)在肝细胞癌组织和细胞中高表达，干扰其表达可抑制肝癌细胞的增殖和转移，诱导细胞凋亡〔6〕。SOX21-AS1在宫颈癌中高表达，敲低其表达抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭〔7〕。微小RNA(miRNA)是一类高度保守的内源性非编码RNA，涉及许多病理和生理过程，包括癌症〔8〕。miR-451a在骨肉瘤中低表达，抑制骨肉瘤细胞的生长和侵袭〔9〕。miR-451a在肝癌组织中显著低表达，过表达miR-451a抑制肝癌细胞的增殖〔10〕。但LncRNA SOX21-AS1对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及LncRNA SOX21-AS1与miR-451a的靶向关系罕见研究报道。本研究探讨荞麦七水提物在胃癌MKN45细胞增殖、迁移、侵袭中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂 胃癌细胞株MKN45购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，荞麦七购自焦作康华药业，RPMI1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司，TRIzol、Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，噻唑蓝(MTT)购自Sigma-Aldrich公司，RIPA裂解液、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所，BCA蛋白检测试剂盒购自美国Pierce公司，细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、p27、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、MMP-14、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记二抗购自北京中杉金桥公司，基质胶购自美国BD公司，si-NC、si-SOX21-AS1、miR-NC、miR-451a、pcDNA-SOX21-AS1、pcDNA、pcDNA-SOX21-AS1购自上海GenePharma公司。

1.2荞麦七水提物制备 荞麦七水提物的制备参照李健等〔3〕的方法进行，即称取50.0 g荞麦七药材粉末，以料液比1∶10的比例加入去离子水，在50℃条件下超声提取40 min，提取2次，合并2次滤液，浓缩、干燥。

1.3临床标本 选取20例2015年5月至2018年10月于焦作市人民医院接受手术治疗的胃癌患者的癌组织及癌旁组织(癌旁组织为距离胃癌组织≥3 cm的正常组织，病理检查未发现癌细胞)为研究对象。其中男14例，女6例，年龄23～75岁，平均年龄51岁。所有患者术前未接受过放化疗，研究前获得每名患者或其家属的知情同意书。标本切除后立即放入液氮中保存。

1.4细胞培养与处理 MKN45细胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。细胞生长至80%汇合时，胰酶消化，按照1∶3的比例接种传代。选取对数生长期的MKN45细胞，制成1×105个/ml的浓度，于37℃、5% CO2培养箱培养24 h，分别加入10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml荞麦七水提物〔3〕，同时将不使用任何处理的细胞设为对照组。

1.5实时荧光定量PCR(qPCR)检测LncRNA SOX21-AS1和miR-451a表达 胃癌组织和MKN45细胞中总RNA的提取使用TRIzol试剂进行，逆转录成cDNA。采用cDNA作为模板，检测LncRNA SOX21-AS1和miR-451a表达。SOX21-AS1正向引物序列为5′-GGCTCAGGTTTAGGCGAGTG-3′，反向引物序列为5′-AGAGGCTCTCCTACTCGTGC-3′；miR-451a正向引物序列为5′-ACACTCCAGCTGGGAAACCGTTACCATTACT-3′，反向引物序列为5′-CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3′。U6作为内参，LncRNA SOX21-AS1和miR-451a水平由2-ΔΔCt方法计算。

1.6MTT检测细胞增殖 将MKN45细胞调整为1×104个/ml，接种于96孔板，培养48 h，将20 μl MTT溶液添加至每孔细胞，孵育4 h，之后添加150 μl二甲基亚砜，室温下震荡培养10 min，用酶标仪检测490 nm处吸光度(OD)值，根据公式计算MKN45细胞生长的抑制率。抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%

1.7Western印迹检测目的蛋白表达 MKN45细胞使用RIPA裂解液在冰上提取5 min，采用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，用10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对蛋白样品进行分离，转至聚偏氟乙烯膜，用5%脱脂牛奶封闭后，膜与CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14、GAPDH一抗孵育过夜，次日，用Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液(TBST)冲洗膜，与二抗孵育1 h，TBST冲洗膜，增强化学发光液显色、显影。

1.8Transwell小室法检测MKN45细胞迁移、侵袭 为了检测细胞侵袭，Transwell上室预先涂上与无血清RPMI1640培养基充分混合的基质胶。MKN45细胞用无血清培养基稀释成5×104个/ml的密度，接种200 μl于上室。同时，将600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培养基加入下室。培养24 h后，用棉签擦拭多余细胞，用甲醛固定，结晶紫染色。置显微镜下观察并记录侵袭细胞数。在细胞迁移过程中，上室不使用基质胶包被，其余步骤与侵袭实验相同。

1.9细胞转染 将5×105个/ml的MKN45细胞接种于6孔板。细胞生长至70%汇合时，按照Lipofectamine 2000试剂说明书的指示，分别在MKN45细胞中转染si-NC、si-SOX21-AS1、miR-NC、miR-451a、pcDNA-SOX21-AS1、pcDNA、pcDNA-SOX21-AS1，其中，转染pcDNA和pcDNA-SOX21-AS的细胞加入荞麦七水提物(40 mg/ml)进行处理。转染48 h后，收集细胞，进行细胞增殖、迁移、侵袭等的检测。

1.10生物信息学预测与双荧光素酶报告实验 starBase工具(http://starbase.sysu.edu.cn/)预测发现，LncRNA SOX21-AS1与miR-451a具有部分结合位点。分别构建含有miR-451a结合位点的野生型SOX21-AS1(WT-SOX21-AS1)和突变型SOX21-AS1(MUT-SOX21-AS1)质粒，利用Lipofectamine 2000试剂将其与miR-451a或miR-NC共转染，48 h后测定荧光素酶相对活性。

1.11统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1LncRNA SOX21-AS1和miR-451a在胃癌组织中的表达 与癌旁组织比较，胃癌组织中LncRNA SOX21-AS1表达量显著升高，miR-451a表达量明显减少(P<0.05)，见表1。

表1 LncRNA SOX21-AS1和miR-451a在胃癌组织中的表达

2.2荞麦七水提物对胃癌MKN45细胞中LncRNA SOX21-AS1和miR-451a表达的影响 与对照组相比，10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml荞麦七水提物明显降低MKN45细胞中LncRNA SOX21-AS1表达量，显著提高miR-451a表达量，且二者均呈浓度依赖性(P<0.05)。见表2。

2.3荞麦七水提物对胃癌MKN45细胞增殖的影响 10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml荞麦七水提物作用的MKN45细胞生长的抑制率明显高于对照组，且呈浓度依赖性(P<0.05)。见表3。相较于对照组，10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml荞麦七水提物明显减少MKN45细胞CyclinD1蛋白表达量，显著提高p21、p27蛋白水平，并呈浓度依赖性(P<0.05)。见图1、表2。

图1 增殖相关蛋白表达

2.4荞麦七水提物对胃癌MKN45细胞迁移、侵袭的影响 10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml荞麦七水提物处理的MKN45细胞迁移细胞数、侵袭细胞数明显低于对照组，并呈浓度依赖性(P<0.05)。同对照组相比，10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml荞麦七水提物显著降低MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表达量，且呈浓度依赖性(P<0.05)。见表3、图2、图3。

图2 荞麦七水提物对胃癌MKN45细胞迁移、侵袭的影响(结晶紫染色，×200)

图3 Western印迹检测MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表达

2.5抑制LncRNA SOX21-AS1表达对胃癌MKN45细胞增殖、迁移、侵袭的影响 在MKN45细胞中转染si-SOX21-AS1，LncRNA SOX21-AS1表达量明显低于si-NC组(P<0.05)。与si-NC组比较，抑制LncRNA SOX21-AS1表达明显增加MKN45细胞增殖抑制率、p21蛋白表达量，显著减少迁移细胞数、侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达量(P<0.05)。见图4、表4、图5。

图4 增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

图5 胃癌MKN45细胞的迁移侵袭(结晶紫染色，×200)

2.6LncRNA SOX21-AS1靶向调控miR-451a的表达 starBase网站预测发现，SOX21-AS1的序列中含有与miR-451a互补的核苷酸序列(图6)。双荧光素酶报告实验数据表明，与miR-NC组相比，miR-451a明显抑制WT-SOX21-AS1荧光素酶活性(P<0.05)，对MUT-SOX21-AS1荧光素酶活性无显著影响(表5)。si-SOX21-AS1组较si-NC组明显提高miR-451a表达量(2.34±0.23 vs 1.00±0.09，P<0.05)，pcDNA-SOX21-AS1组较pcDNA组显著降低miR-451a表达量(0.39±0.04 vs 1.01±0.08，P<0.05)。

图6 SOX21-AS1的序列中含有与miR-451a互补的核苷酸序列

表5 双荧光素酶报告实验

2.7LncRNA SOX21-AS1过表达逆转了荞麦七水提物(40 mg/ml)对胃癌MKN45细胞增殖、迁移、侵袭的作用 与对照组比较，荞麦七水提物(40 mg/ml)明显影响MKN45细胞中SOX21-AS1、miR-451a、抑制率、迁移细胞数、侵袭细胞数、CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表达(P<0.05)。同荞麦七水提物+pcDNA组相比，荞麦七水提物+pcDNA-SOX21-AS组明显提高MKN45细胞中SOX21-AS1表达量、迁移细胞数、侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达(P<0.05)，显著降低miR-451a表达量、抑制率、p21蛋白表达(P<0.05)。见图7、图8、表6。

1～4：对照组,荞麦七水提物组，荞麦七水提物+pcDNA组，荞麦七水提物+pcDNA-SOX21-AS1组图7 Western印迹检测CyclinD1、P21、MMP-2、MMP-9蛋白表达

图8 LncRNA SOX21-AS1过表达逆转了荞麦七水提物对胃癌MKN45细胞迁移、侵袭的作用(结晶紫染色，×200)

3 讨 论

胃癌的发展是一个多步致癌过程，涉及大量的遗传和表观遗传改变。尽管在外科手术和分子靶向治疗方面取得了快速进展，但胃癌患者的临床结果仍不乐观。根据报道，2013年我国胃癌患者死亡病例达约30.1万例〔11〕。可能是由于肿瘤细胞的快速增殖、迁移、侵袭和耐药，导致胃癌患者预后不良。现有的胃癌化疗药物缺乏稳健的疗效，并伴有许多副作用。因此，目前的研究集中在预防和治疗胃癌及其他恶性肿瘤的更有效且副作用更低的药物方面。

荞麦七是我国传统中药，始载于《图经本草》〔2〕，包含黄酮类、酚酸类、三萜类等活性成分。现代药理研究表明，荞麦七提取物对枯草芽孢杆菌及铜绿假单胞菌等表现出显著的体外抑制作用〔12〕，还可清除羟基自由基，抑制超氧阴离子自由基〔13〕。除了显著的抑菌、抗氧化等活性，荞麦七被发现具有抗癌活性。研究发现，随着荞麦七水提物浓度的增加和作用时间的延长，肺癌A549细胞的存活率逐渐减低，显示出一定的抗肿瘤作用〔3〕。不同浓度的荞麦七提取物可以抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖及细胞中MMP-9、C-myc蛋白表达，影响细胞的浸润转移〔4〕。而关于荞麦七对胃癌的影响尚未见诸报道。本研究发现荞麦七水提物以浓度依赖方式明显抑制胃癌MKN45细胞增殖、迁移和侵袭，减少CyclinD1、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表达而显著提高p21、p27蛋白水平，为荞麦七的抗肿瘤作用提供了新的证据。

LncRNA影响细胞增殖、细胞分化和凋亡等许多细胞和发育过程〔14〕。现阶段，失调LncRNA在肿瘤中的功能越来越受到关注。LncRNA可能通过作为肿瘤抑制因子或致癌基因，在癌症的发生发展过程中发挥复杂而广泛的调控作用，包括胃癌〔15，16〕。研究报道了SOX21-AS1在几种肿瘤中的生物学功能，例如，SOX21-AS1在肺腺癌中高表达，敲低其表达可显著抑制肺腺癌细胞的增殖，促进细胞凋亡〔17〕。SOX21-AS1在结直肠癌组织和细胞中高表达，沉默其表达可抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭〔18〕。这些研究揭示SOX21-AS1可作为肿瘤促进剂。然而，SOX21-AS1在胃癌中的表达及其作用鲜见报道。本实验中，SOX21-AS1在胃癌组织中表达上调，抑制其表达明显抑制胃癌MKN45细胞的增殖、迁移和侵袭，这与前述结论一致，SOX21-AS1在胃癌进展中起致癌作用。另外，荞麦七水提物以浓度依赖方式降低MKN45细胞中SOX21-AS1表达，推测荞麦七水提物的抗胃癌作用与下调SOX21-AS1表达有关。

本实验发现，miR-451a在胃癌组织中表达下调，这与其他癌症〔9,10,〕中的表达情况相同。Shen等〔19〕报道指出，miR-451a通过靶向活化转录因子(ATF)2抑制非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭。Xu等〔20〕发现，miR-451a通过调控结直肠癌中B细胞受体相关蛋白(BAP)31，诱导内质网应激，从而抑制细胞增殖和诱导凋亡。这些研究说明miR-451a在癌症中扮演着抑癌基因的角色。本项研究中，荞麦七水提物以浓度依赖方式提高胃癌MKN45细胞中miR-451a表达，推测miR-451a同样参与荞麦七水提物的抗癌作用，荞麦七水提物可能通过抑制SOX21-AS1，促进miR-451a表达来调控胃癌细胞增殖、迁移侵袭。