远志皂苷调控miR-325-5p/GADD45B对高糖诱导小鼠足细胞损伤的影响及其机制

高虹 焦宏伟 贝宁 叶苗苗

(海南省干部疗养院 海南省老年病医院内科，海南 海口 571100)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的常见并发症之一，足细胞在DN的发病机制中起关键作用，高糖导致足细胞肥大、脱落和凋亡，足细胞裂孔膜蛋白nephrin和podocin表达下调，产生蛋白尿〔1〕。研究发现远志皂苷(TEN)对Aβ140引起的神经细胞毒性〔2〕、大鼠心肌缺血再灌注损伤〔3〕及过氧化氢诱导的PC12细胞损伤〔4〕有明显的保护作用。但具体机制尚不清楚。miR-325-3p在糖尿病大鼠视网膜中miR-325-3p表达下调，叔丁基对苯二酚通过上调miR-325-5p表达对2型糖尿病大鼠视网膜起保护作用〔5〕。本研究通过StarBase预测发现，GADD45B可能是miR-325-5p的靶基因。GADD45B是DNA损伤修复的重要相关基因家族成员之一，转化生长因子(TGF)-β刺激引起的足细胞损伤中上调表达〔6〕。本研究假设远志皂苷通过调控miR-325-3p/GADD45B通路影响高糖诱导的小鼠足细胞损伤，以小鼠肾脏足细胞系MPC5高糖诱导产生的细胞损伤为模型，并对此假设进行验证。

1 材料与方法

1.1材料 小鼠永生性肾脏足细胞系MPC5购自ATCC；RPMI1640培养基和胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；TEN(纯度98.5%)购自成都普思生物科技股份有限公司；干扰素(IFN)-γ、鼠尾胶原蛋白Ⅰ、胰蛋白酶Trypsin购自Sigma-Aldrich公司；抗GADD45B抗体、抗podocin抗体、抗nephrin抗体、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购自英国Abcam公司；Lipofectamine 2000转染试剂、总RNA提取试剂Trizol、 实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)试剂盒、RT-PCR反转录试剂盒购自美国Invitrogen公司；流式法细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；miR-325-3p模拟物(miR-325-3p)/miR-325-3p抑制剂(anti-miR-325-3p)、阴性对照(miR-NC和anti-miR-NC)、GADD45B的野生型(WT-GADD45B)和突变型(MUT-GADD45B)双荧光报告载体购自上海吉玛基因；双荧光素酶报告系统购自美国Promega公司；流式细胞仪购自美国BD公司，实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养、分化和分组〔7〕细胞培养和分化：将MPC5在含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素及10 U/ml IFN-γ的RPMI1640培养基中培养，置33℃ 5%CO2、湿度95%的培养箱中培养，待细胞基本融合为一层时，收集细胞，将传代的MPC5细胞转入瓶底铺有0.1 mg/ml的鼠尾胶原蛋白Ⅰ分化培养液中，37℃ 5%CO2、湿度95%的条件下培养12～14 d，细胞分化成熟。

实验分组：对照(NG)组：RPMI1640培养基+D-葡萄糖5 mmol/L；高糖刺激(HG)组：RPMI1640培养基+D-葡萄糖30 mmol/L；高糖刺激+TEN(HG+TEN)组：RPMI1640培养基+D-葡萄糖30 mmol/L+TEN 50、100 或200 μmol/L即为HG+TEN-L组、HG+TEN-M组、HG+TEN-H组；高糖刺激+转染(HG+转染)组：转染48 h后用RPMI1640培养基+D-葡萄糖30 mmol/L进行处理24 h；高糖刺激+TEN+转染(HG+TEN+转染)组：转染48 h后用RPMI1640培养基+D-葡萄糖30 mmol/L+TEN 200 μmol/L进行处理24 h。

1.2.2细胞转染 将MPC5以每孔4×105个细胞/孔接种于6孔板中，培养至细胞融合度为80%～90%时进行转染。转染分组：miR-325-3p过表达组(转染miR-325-3p，以miR-NC为对照)，miR-325-3p抑制组(转染anti-miR-325-3p，以anti-miR-NC为对照)，双荧光素酶报告系统组(转染miR-325-3p+WT-GADD45B、miR-NC+WT-GADD45B、miR-325-3p+MUT-GADD45B或miR-325-3p+WT-GADD45-B)。将无血清培养液稀释的等体积脂质体和各组载体混合，室温孵育20 min，加入培养好的细胞中，培养6 h，弃无血清培养液，加入RPMI1640完全培养基，转染48 h，收集细胞。

1.2.3qRT-PCR检测miR-325-3p和GADD45B mRNA的表达 收集各组MPC5细胞，按照总RNA提取试剂盒的说明书提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，取cDNA为模板按照qRT-PCR的说明书进行反应合成miR-325-3p和GADD45B mRNA，反应程序为：95℃ 5 min；94℃ 30 s、59℃ 40 s、72℃ 45 s，42个循环；72℃ 10 min。用2-ΔΔCt方法进行数据分析。

1.2.4Western印迹检测蛋白表达 收集各组MPC5细胞，加入放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液裂解细胞，然后进行超声破碎，收集细胞中的蛋白，测定总蛋白浓度。将蛋白样本进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，封闭2 h，加入稀释的各个一抗(GADD45B抗体1∶1 000、podocin抗体1∶1 000、nephrin抗体1∶1 000、Bcl-2抗体1∶2 000、Bax抗体1∶3 000和GAPDH抗体1∶4 000)，4℃孵育过夜，洗膜2次，加入稀释的酶标记二抗，室温孵育2 h，以GAPDH 为内参。

1.2.5流式细胞术测定细胞凋亡率 收集经葡萄糖或(和)TEN处理或转染后各组MPC5细胞，胰酶消化，离心收集细胞，按照膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)试剂盒说明书进行操作，加入Annexin V-FITC和PI各5 μl，混匀，室温避光15 min，流式细胞仪检测凋亡率。

1.2.6双荧光素酶报告实验 根据1.2.2进行MPC5细胞培养和转染，将构建的PRMT5的野生型(WT-PRMT5)和突变型(MUT-PRMT5)双荧光素酶报告载体分别与miR-NC或miR-188-5p共转染MPC5细胞，转染后培养48 h，收集细胞并进行裂解，离心收集上清，加入荧光素酶底物，发光仪检测荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参照，计算相对萤火虫荧光素酶活性。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析和t检验。

2 结 果

2.1TEN对高糖诱导的小鼠足细胞中podocin和nephrin蛋白表达的影响 与NG组相比，HG组podocin和nephrin 蛋白表达量均显著降低(P<0.05)；与HG组相比，HG+TEN-L组、HG+TEN-M组和HG+TEN-H组的podocin和nephrin蛋白表达量均显著升高(P<0.05)，呈浓度依赖趋势均(P<0.05)，见图1、表1。说明TEN可以促进高糖诱导的小鼠足细胞中podocin和nephrin的表达，抑制高糖诱导的小鼠足细胞损伤。

1～5：NG组，HG组，HG+TEN-L组，HG+TEN-M组，HG+TEN-H组，下图同图1 Western印迹检测podocin和nephrin蛋白表达

2.2TEN对高糖诱导的小鼠足细胞凋亡的影响 与NG组相比，HG组MPC5细胞凋亡率和Bax水平显著上升(P<0.05)，Bcl-2表达量显著降低(P<0.05)；与HG组相比，HG+TEN-L组、HG+TEN-M组和HG+TEN-H组足细胞凋亡率和Bax水平显著下降(P<0.05)，Bcl-2表达量显著升高(P<0.05)，呈浓度依赖性(均P<0.05)。见表1、图2、图3。说明高糖促进小鼠足细胞凋亡，TEN抑制了高糖诱导的小鼠足细胞凋亡。

图2 TEN对高糖诱导的小鼠足细胞凋亡的影响

图3 Western印迹检测凋亡相关蛋白表达

2.3TEN对高糖诱导的小鼠足细胞中miR-325-3p和GADD45B表达的影响 与NG组相比，HG组MPC5细胞中miR-325-3p表达显著下调(P<0.05)，GADD45B mRNA和蛋白表达显著上调(P<0.05)；与HG组相比，HG+TEN-L组、HG+TEN-M组和HG+TEN-H组足细胞中miR-325-3p表达显著上调(P<0.05)，GADD45B mRNA和蛋白表达显著下调(P<0.05)，呈浓度依赖性(P<0.05)。见表1、图4。说明高糖可下调小鼠足细胞miR-325-3p水平并上调GADD45B水平，TEN逆转了这一作用。

图4 Western印迹检测GADD45B蛋白表达

2.4miR-325-3p靶向调控GADD45B的表达 通过StarBas预测显示，GADD45B的3′UTR序列中含有与miR-325-3p互补的核苷酸序列，见图5。与miR-NC组相比，miR-325-3p组GADD45B野生型WT-GADD45B荧光素酶相对活性显著下降(P<0.05)，而突变型MUT-GADD45B荧光素酶相对活性无明显变化(P>0.05)。见表2。miR-325-3p组GADD45B蛋白(0.22±0.03)显著低于miR-NC组(0.41±0.04，P<0.05)；anti-miR-325-3p组GAPD-45B蛋白(0.83±0.08)显著高于anti-miR-NC组(0.38±0.03，P<0.05)。见图6。说明miR-325-3p靶向负调控GADD45B的表达。

图5 GADD45B的3′UTR中含有与miR-325-3p互补的核苷酸序列

表2 双荧光素酶报告实验

1～4：miR-NC组，miR-325-3p组，anti-miR-NC组，anti-miR-325-3p组图6 Western印迹检测各组GADD45B水平

2.5miR-325-3p过表达对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的影响 与HG+miR-NC组相比，HG+miR-325-3p组MPC5细胞中miR-325-3p、podocin、nephrin和Bcl-2水平显著上升(P<0.05)，GADD45B、Bax蛋白表达水平及细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，见表3、图7、图8。说明过表达miR-325-3p可抑制高糖诱导的小鼠足细胞MPC5损伤，并抑制细胞凋亡。

1～2：HG+miR-NC组，HG+miR-325-3p组图7 Western印迹检测GADD45B、podocin、nephrin及凋亡蛋白水平

图8 miR-325-3p过表达对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的影响

2.6抑制miR-325-3p表达逆转了TEN(200 μmol/L)对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的作用 与HG+TEN+anti-miR-NC组相比，HG+TEN+anti-miR--325-3p组miR-325-3p、podocin、nephrin和Bcl-2含量显著下降(P<0.05)，GADD45B、Bax蛋白表达量及细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，见图9、表4。

1，2：HG+TEN+anti-miR-NC组，HG+TEN+anti-miR-325-3p组图9 抑制miR-325-3p表达逆转了TEN对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的作用

3 讨 论

TEN是中药远志的活性成分之一，具有祛痰镇咳、益智、保护心脑血管、抗老年痴呆等功能〔8〕。目前针对TEN的主要研究集中在抗老年痴呆、益智等方面。研究表明，在2型糖尿病和阿尔茨海默病(AD)小鼠模型中，TEN可改善小鼠记忆障碍，调控2型糖尿病小鼠的血糖和血脂，具有益智和降糖作用〔9〕。本研究结果说明TEN对足细胞具有潜在的临床保护作用。

生长阻滞和GADD45B是GADD45基因家族中的一员，参与细胞周期阻滞、细胞存活或凋亡及DNA损伤修复等过程〔10〕。研究表明GADD45B在斑马鱼足细胞损伤模型中表达上调，可能通过激活ROS-GADD45B-p38通路加重水肿、蛋白尿和足突消退，敲除GADD45B可改善足细胞损伤〔11〕。雷公藤内酯醇通过抑制p53-NF-κB/GADD45B信号传导而减轻蛋白尿和足细胞凋亡，GADD45B在斑马鱼足细胞中的特异性过表达消除了雷公藤内酯醇对足细胞的保护作用〔12,13〕。

miR-325-3p在非小细胞肺癌和乙型肝炎型肝细胞癌中表达异常，与癌症的进展和化疗耐药性有关〔14,15〕。本研究结果说明TEN确实通过调控miR-325-3p发挥对足细胞的保护作用。