烟草米根霉致病力及不同渗透压和p H环境下的代谢表型特征分析

陈乾丽，汪汉成，黄 洋，李文红，蔡刘体，谭清群，陈兴江，李 忠

1.贵州省烟草科学研究院，贵阳市观山湖区龙滩坝路29号 550081

2.贵州大学农学院，贵阳市花溪区甲秀南路 550025

3.四川中烟工业有限责任公司技术中心，成都市锦江区成龙大道一段56号 610066

4.贵州省农业科学院植物保护研究所，贵阳市花溪区金竹镇 550006

烟叶霉烂病（Tobacco pole rot）是烟叶在烘烤期间发生的一种真菌性病害，具有爆发性强和危害性大的特点［1］，可引起烘烤期间烟叶严重霉变，造成烟叶产质量损失［2-3］，在我国云南、贵州和福建等烟区均有发生和危害［4-7］。该病害由米根霉（Rhizopus oryzae）引起，是一种繁殖速度快、耐热性强的真菌，可以在适宜环境条件下摄取烟叶营养物质，破坏烟叶组织［8］。在烟叶烘烤期间，米根霉主要危害叶柄，也可侵染叶片［6-7］。受烤房温湿度影响，米根霉在不同烘烤阶段和烤房部位常表现出不同的侵染能力。米根霉侵染能力与病原菌的致病力及烟叶所处的环境条件密切相关［9］。关于烟叶霉烂病危害温度范围已有一些报道，Gayed［10］研究发现，烟叶霉烂病菌在25~37℃时生长繁殖较快，高于40℃时生长减缓；陈二龙等［11］试验提出，烤房易发生烟叶霉烂病的温度范围为32~42℃；苏家恩等［12］研究认为，烟叶霉烂病终止危害温度在45℃左右。但有关温度、烟叶成熟度、外源创伤对米根霉致病力的影响尚不明确，病原菌的渗透压和pH环境也不清楚。为此，以米根霉为研究对象，对其可致病的温度范围进行测定，同时对不同成熟度烟叶以及创伤对其致病力的影响进行了检测，并应用微生物代谢表型技术（Biolog）分析了不同渗透压和pH环境下米根霉的代谢表型，旨在确定影响米根霉致病力的关键温度范围及不同渗透压及pH环境下病原菌的适应能力，为烟叶霉烂病的有效防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株与烟草品种：米根霉菌株Y5（CCTCC M 2015720），由贵州省烟草科学研究院微生物实验室分离获得，供试烟草品种为云烟87。

供试培养基与试剂：采用PDA培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15~20 g、蒸馏水1 000 mL）培养米根霉。Biolog PM 9渗透压代谢板（#12161）、PM 10 pH代谢板（#12162）、接种液FF-IF（#72106），OmniLog PM系统（91171）、浊度测定仪（3531）、Turbidimeter（3531）及多通道电动移液器（3501A），均购自美国Biolog公司。

1.2 试验方法

1.2.1 不同温度条件下米根霉致病力的测定

米根霉于PDA培养基上30℃培养48 h，用7 mm打孔器打取菌碟，将菌碟置于烟草离体叶片上，以未接菌培养基为对照。接菌后将叶片置于不同温度（20℃、25℃、30℃、35℃、38℃和45℃）环境下培养，分别于接菌后24 h和48 h时观察叶片发病情况，测量病斑直径，并计算病斑面积。

1.2.2 米根霉对叶柄和叶片致病力的测定

在PDA平板上制备米根霉菌碟（直径7 mm），将菌碟分别置于烟叶叶柄与叶片上。接菌后的烟叶置于相对湿度（RH）80%和38℃的环境下培养，分别于接菌后24 h和48 h时观察烟叶叶柄和叶片的发病情况，并测量病斑的直径，计算病斑面积。

1.2.3 创伤对米根霉致病力影响的测定

制备米根霉菌碟（直径7 mm），将菌碟分别置于有创伤与无创伤的烟叶上。接菌后将叶片置于RH 80%和38℃的环境下培养，于接菌后24 h和48 h观察叶片发病情况，并测量病斑直径，计算病斑面积。

1.2.4 米根霉对不同叶位烟叶致病力的测定

将米根霉菌碟分别置于不同部位的离体叶片（顶叶、上二棚、腰叶、下二棚和脚叶）上。接菌后将叶片置于RH 80%和38℃的环境下培养，分别于接菌后24 h和48 h观察叶片发病情况，并测量病斑直径，计算病斑面积。

1.2.5 不同渗透压和pH环境下米根霉代谢特征分析

参照Biolog标准程序［13-15］对烟叶米根霉的渗透压和pH环境下的代谢表型进行分析。将供试菌株在PDA平板上25℃培养48 h，直至产生大量孢子。用无菌水润湿无菌棉签，在菌落表面旋转蘸取孢子，将其定容至12 mL的FF-IF接种液中，将孢子悬浮液浓度调至62%T（T为Biolog标准浓度单位）。吸取600µL孢子悬浮液添加至22.24 mL的PM 9和PM 10接种液中，制备混合接种液，将混合接种液加入PM 9和PM 10代谢板中。将接菌后的代谢板置于35℃恒温培养箱中培养8 d。设置OmniLog工作软件Biolog D5E_OKA_data.exe，记录米根霉生长过程中代谢板孔内的颜色变化值，采用Biolog OL_FM_1.2.exe软件进行颜色值转换，用Biolog OL_PR_1.2.exe软件分析其代谢特征。

2 结果与分析

2.1 温度对米根霉致病力的影响

致病力测定结果（图1）表明，在20℃~45℃测试温度范围内，米根霉可致病温度范围为20℃~38℃。20℃时，接菌后48 h时离体叶片开始发病；25℃~38℃处理，接菌后24 h时叶片发病；38℃时，病斑扩展速度最快。

图1 温度对米根霉致病力的影响Fig.1 Effects of temperature on pathogenicity of Rhizopus oryzae

2.2 米根霉对叶柄和叶片的致病力

烟草离体叶片的叶柄和叶片组织接种米根霉后均可发病，接种后24 h时叶柄和叶片的平均病斑面积分别为4.33 cm2和1.65 cm2，接种后48 h时叶柄和叶片的平均病斑面积分别为13.5 cm2和3.72 cm2。

2.3 创伤对米根霉致病力的影响

创伤对米根霉致病力的影响较大，烟叶存在创伤时米根霉更容易侵染。接种后24 h时，创伤和无创伤烟叶的平均病斑面积分别为5.01 cm2和0.60 cm2，接种后48 h时的平均病斑面积分别为12.68 cm2和3.31 cm2。

2.4 米根霉对不同叶位烟叶的致病力

米根霉对不同叶位烟叶均具有致病力，见表1。叶位自下向上，叶片发病面积随叶位的增加而逐渐减小。脚叶的病斑扩展速度最快，顶叶的病斑扩展速度最慢，可见米根霉对底部叶片的致病力最强。

表1 米根霉对不同叶位烟叶致病力的影响①Tab.1 Effects of stalk position on pathogenicity of Rhizopus oryzae to tobacco leaves

2.5 不同渗透压和p H环境下米根霉的代谢特征

米根霉在Biolog PM 9和PM 10代谢板上的渗透压和pH环境下的代谢表型特征见图2。米根霉具有广泛的渗透压和pH环境适应能力，能在83种渗透压环境下生长，包括1%~10%（质量分数）氯化钠、3%~6%（质量分数）氯化钾、2%~5%（质量分数）硫酸钠、5%~20%（体积分数）乙二醇、1%~2%（质量分数）甲酸钠、2%~3%（质量分数）尿素、1%~12%（质量分数）乳酸钠、20~200 mmol·L-1的磷酸钠（pH 7）、10~100 mmol·L-1的硫酸铵（pH 8）、10~100 mmol·L-1的硝酸钠、10~100 mmol·L-1的亚硝酸钠，6%氯化钠及6%氯化钠与甜菜碱、氯化钾、肌氨酸、二甲基磺酰基丙酸盐、丙磺酸、四氢嘧啶、胆碱、磷酸胆碱、肌酸、肌酐、左旋肉碱分别共存的渗透压环境中生长；不能在3%~6%（质量分数）甲酸钠、4%~7%（质量分数）尿素及20~200 mmol·L-1苯甲酸钠（pH 5.2）的环境中生长，见表2。

表2 （续）

图2 米根霉在Biolog PM 9和PM 10代谢板上的代谢特征Fig.2 Metabolic characteristics of Rhizopus oryzae on Biolog PM 9 and PM 10 microplates

表2 米根霉在不同渗透压环境下的代谢表型特征①Tab.2 Metabolic characteristics of Rhizopus oryzae in different osmotic environments

米根霉能在86种pH环境下正常生长，包括pH环境3.5~10.0，pH 4.5时能在与L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-谷酰胺等35类物质分别共存的环境中生长，pH 9.5时能在与L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-谷酰胺、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-酪氨酸、邻氨基苯甲酸、色胺、氧化三甲胺、尿素，及辛酯酶、葡萄糖苷、半乳糖苷、葡糖苷酸、氨基葡糖苷、氨基半乳糖苷、甘露糖苷、磷酸盐和硫酸盐等分别共存的环境中生长，pH 9.5时不能在与L-天门冬酰胺、L-天冬氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯基丙氨酸、L-苏氨酸分别共存的环境中生长，见表3。

表3 （续）

表3 米根霉在不同pH环境下的代谢表型特征Tab.3 Metabolic phenotypic characteristics of Rhizopus oryzae under different p Hs

3 讨论

本试验结果显示，烟叶米根霉的最低致病温度为20℃，最强致病力温度为38℃，在45℃条件下不能侵染烟叶，这与陈二龙等［11］的研究结果基本一致。不同温度条件下米根霉的致病力变化趋势与其生长速率的变化趋势相似，病害潜伏期随温度升高而缩短，在45℃时致病力下降，这与温度对米根霉菌丝生长速率的影响一致［10］。

本试验中还发现米根霉侵染不同叶位的烟叶时病斑扩展速度存在差异，顶叶病斑扩展最慢，脚叶病斑扩展最快，上二棚叶、腰叶和下二棚烟叶间无明显差异。由于不同叶位烟叶的成熟度不同［16］，推测米根霉致病力与烟叶成熟度密切相关，还有待进一步试验验证。此外，试验中还发现米根霉接种后，烟叶叶柄和叶片组织均发生霉烂，但烟叶存在创伤时烟叶霉烂速度更快，无创伤时霉变速度相对较慢。这与烘烤期间烟叶霉烂病从叶柄创伤处开始发生，沿着叶基逐渐向叶片主脉、侧脉及叶肉扩展的现象一致［17］，推测叶柄创伤为米根霉侵染创造了有利条件。烟草霉变通常是微生物、环境和寄主等多因素互作的结果，其中温度与湿度是重要的影响因子。本试验中仅测定了温度对米根霉致病力的影响，而有关米根霉的可致病湿度范围，以及多种因素交互作用模式下烟叶霉烂病的发生发展规律还有待进一步研究。

本研究中，基于Biolog代谢表型技术测定了米根霉可生长和产孢的pH范围在3.5~10.0之间，当pH为4.5时，米根霉能代谢大部分被测试的氨基酸；当pH为9.5时，不能代谢大部分被测试的氨基酸，表明米根霉具有较强的脱羧酶活性和较弱的脱胺酶活性。这与米根霉在发酵工程上的应用结果一致［18］。米根霉对不同渗透压物质表现出不同的代谢活性，反映了米根霉在不同逆境条件下的环境适应力，如≥3%（质量分数）甲酸钠、≥4%（质量分数）尿素、≥20 mmol·L-1苯甲酸钠等均不能生长和产孢。因此通过施用不同浓度渗透压物质控制烟叶霉烂和减轻危害具有潜力，但还有待进一步试验验证。

4 结论

米根霉的可致病的温度范围为20℃~38℃，45℃时无致病力；烟叶叶柄创伤有利于病原菌的侵染，米根霉对烟株下部叶的致病力大于上部叶；米根霉具有广泛的渗透压和pH适应能力，能在1%~10%氯化钠、3%~6%氯化钾、2%~5%硫酸钠、5%~20%乙二醇等渗透环境中正常生长，不能在3%~6%甲酸钠、4%~7%尿素的渗透环境中生长；米根霉适应pH范围为3.5~10.0，最适pH约为7.0；米根霉具有较强的脱羧酶活性和较弱的脱胺酶活性。