木糖渣酶解耦合机械处理制备球形纳米纤维素

苏荣欣 ，王洁樱 ，黄仁亮，崔 美 ，齐 崴 ，何志敏

(1. 天津大学化工学院，天津 300350；2. 化学工程联合国家重点实验室(天津大学)，天津 300350；3. 天津大学海洋科学与技术学院，天津 300072)

纳米纤维素(nanocellulose，NC)是一类至少有一个维度在纳米尺度的纤维素材料的统称[1]，具有无毒、低成本、低密度、高强度以及高模量等优点[2-3]，已应用于药物靶向递送[4]、生物负载[5]、3D打印[6]、酶固定化[7]、水处理、重金属离子吸附及环境治理等诸多领域[8]，受到各国科研工作者广泛关注．例如，Lassoued等[9]在纯水介质中用甲基丙烯酸缩水甘油酯对纤维素纳米纤维进行化学改性，合成了透明、可生物降解且具有很强机械性能的薄膜，可作为防弹玻璃的夹层使用．纳米纤维素的制备方法主要有酸水解法、氧化法、离子液体法、机械法和酶解法等．例如，Zhang等[10]以竹子为原料，经甲酸预处理(85%甲酸，145℃，45min)后通过TEMPO氧化制得长度80～300nm、直径5～9nm纤维素纳米晶；Liu等[11]以小麦秸秆为原料，组合采用蒸汽爆破、微波辅助碱水解和微射流法制备了直径为10～40nm的纤维素纳米纤维．

球形纳米纤维素(spherical nanocellulose，SNC)是几何形状为球形的纤维素纳米晶，具有高热稳定性、生物降解性、生物相容性等优点[12]．例如，Meyabadi等[13]对棉花纤维进行酶水解和超声处理，制备了平均粒度小于100nm的球形纳米纤维素，有望应用于晶体管和电池中．Hakkak等[14]采用离子液体法，以微晶纤维素和1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐(EMIMAc)为主要试剂，制备了大小为100～400nm的SNC．Li等[15]以微晶纤维素为原料，先经过转晶处理，再用65%浓硫酸水解制得直径为(100±3)nm的SNC，并利用其良好的乳化性能，将其应用于稳定O/W型的Pickering乳液[16]．贾梦雨等[17]以纸浆(桉木浆板)为原料，加入400U/mL的复合酶(纤维素酶与木聚糖酶)于50℃下反应5h制备得到100nm以下的球形纳米纤维素，与壳聚糖共混制备出阻水阻氧、热稳定性和弹性模量较高的复合膜．微晶纤维素、纸浆等原料成本较高限制了SNC的规模化制备，因此迫切需要寻找一种低成本生物质原料．

木糖渣是玉米芯经过酸处理提取木糖后的固体残渣，由于生产木糖主要是利用玉米芯中的半纤维素成分，所以木糖渣的主要成分为纤维素和较容易脱除的木质素[18]．为了实现废弃生物质的资源化利用，本研究以木糖渣为原料，采用酶解耦合超声破碎或高压均质制备了SNC．考察了不同预处理、酶解时长、超声破碎时长、高压均质压力与循环次数对SNC形貌、粒径、结晶度和产率的影响．

1 实 验

1.1 材料与仪器

高速多功能粉碎机(天祺盛世工贸有限公司)，恒温水浴振荡器(优莱博技术有限公司)，高速离心机(德国Sigma)，超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，高压均质机(安拓思纳米技术有限公司)，纳米粒度及Zeta电位仪(马尔文)，X射线衍射仪(德国Bruker)，场发射扫描电子显微镜(日本日立公司)，原子力显微镜(德国Bruker)．

木糖渣(山东龙力生物科技有限公司)，纤维素酶(夏盛酶生物技术有限公司)，过氧化氢(H2O2，30%，北京伊诺凯科技有限公司)，氢氧化钠(NaOH，96%)和甲醇(CH3OH，AR)均购自上海阿拉丁公司．

1.2 木糖渣预处理

将木糖渣在60℃鼓风干燥箱中烘干，然后用粉碎机粉碎通过100目筛网并收集．将氢氧化钠溶解在以下3种溶剂中，配置成质量分数为2.5%[19]的混合碱液：甲醇(NaOH-CH3OH)、水(NaOH)和2%过氧化氢(NaOH-H2O2)．各取200mL，分别向其中投入20g或10g(NaOH-H2O2)100目木糖渣，80℃处理3h或50℃处理6h(NaOH-H2O2)[20]，整个过程均在转数为120r/min的振荡摇床中进行．反应结束后进行固液分离，将收集得到的固体水洗至中性，然后于60℃鼓风干燥箱中烘干、粉碎待用．

1.3 球形纳米纤维素的制备

往锥形瓶中加入1g预处理后的木糖渣和99mL双蒸水，室温下提前润胀2h，再加入500FPU纤维素酶，在50℃(酶最佳使用温度)、120r/min的恒温水浴振荡器中反应，沸水浴15min终止反应．调节pH值为4使产物沉降[21-23]，8000r/min高速离心30min，收集沉淀并水洗至中性，然后加入80mL双蒸水进行超声破碎或高压均质处理．结束后2000r/min离心15min，收集上清悬浮液，冻干备用.

1.4 球形纳米纤维素的表征

将冻干的SNC粉末研磨粉碎，取0.5g样品在样品台上压实压平，用XRD测试[24](Cu靶，加速电压40kV，工作电流40mA，扫描范围2θ＝5°～30°，扫速5°/min)．配制质量分数为0.01%的SNC悬浮液，取1.5mL加入石英比色皿中，用纳米粒度及Zeta电位仪测试粒径分布[25]．取50µL滴于云母片上，3min后用氮气吹干，用于AFM测试(接触模式，扫描频率1Hz)．取50µL滴至玻璃片上，放入烘箱中至完全干燥，进行镀金处理(E1045 镀膜机，15mA，80s)，用于SEM测试(电压5kV)．

1.5 分析方法与数据处理

木糖渣组分参照美国可再生能源实验室(NREL)标准分析规程LAP-002(2008)进行测定．木质素去除率计算式为

式中：Δω为木质素去除率，%；0ω为木糖渣中木质素含量；1ω为预处理后木糖渣中木质素含量．

采用MDI Jade 6.5软件对XRD所测数据进行分析，拟合出结晶区衍射峰以及非结晶区衍射峰，按式(2)计算：

式中：Xc为结晶度，%；Ac为结晶区衍射峰总面积；Aa为非结晶区衍射峰总面积．

球形纳米纤维素的产率按式(3)计算：

式中：η为SNC产率，%；m1为制得SNC的质量；m0为加入预处理后木糖渣的质量．

2 结果与讨论

2.1 木糖渣预处理方法的确定

如图1所示，样品在22°的衍射峰与纤维素Ⅰ的晶体结构有关[26]；碱处理后峰变得更窄、更尖锐，这表明结晶度在增加．这可能是在碱处理过程中去除了无定型木质素，同时从纤维素中去除了无定形区域[27-29]．

图1 预处理对木糖渣结晶度的影响Fig.1 Effect of pretreatment on the crystallinity of corncob residues

从表1可见，未处理的木糖渣木质素含量为26.0%，NaOH-CH3OH、NaOH和NaOH-H2O23种碱性溶液均有效地去除了原料中的木质素，使木质素含量分别降低至9.4%、7.8%和8.2%，对木糖渣中木质素的去除率分别为64.0%、70.2%和68.3%．未处理的木糖渣结晶度为50.1%，采用NaOH-CH3OH处理后结晶度有所提高，达到51.3%；NaOH处理后结晶度为72.5%；NaOH-H2O2处理后的木糖渣结晶度提高得最多，增大至74.7%．通过比较发现，NaOH和NaOH-H2O2预处理都具有较高的木质素去除率和结晶度，但H2O2具有漂白效果，使得预处理后木糖渣由褐色变成白色，有利于后续制备高纯纳米纤维晶．因此，本文选择2.5%NaOH-H2O2溶液为预处理液，用于制备SNC的原料均是基于NaOH-H2O2预处理后的木糖渣．在该条件下，预处理液的pH值为11.5，此时溶液中含有高活性自由基[30]，即H2O2解离产生的过氧自由基和羟基自由基(见式(4)和(5)).这些自由基将木质素降解成低分子质量化合物，从而实现木质素的有效脱除[31]，提高原料的结晶度．

表1 预处理对木糖渣木质素含量、木质素去除率与结晶度的影响Tab.1 Effects of pretreatment on the lignin content，lignin removal rate，and crystallinity of corncob residues

2.2 球形纳米纤维素形貌分析

图2为预处理后的木糖渣在酶解3h耦合超声破碎120min、高压均质20MPa循环5次或80MPa循环25次条件下制备的SNC的扫描电镜图和原子力显微镜图．SEM和AFM均表明所制备的纳米纤维素为大小均匀的球形．由图2(a)可见，超声处理后球形纳米纤维素粒径分布在40～60nm之间，大于Liu等[11]制备的纳米纤维素(直径10～40nm)；而20MPa高压均质下球形纳米纤维素粒径分布在600～800nm之间(图2(b))．进一步提高均质压力和循环次数，在80MPa下循环25次后球形纳米纤维素粒径为5～10nm，直径接近于Zhang等[10]制备的纤维素纳米晶(直径5～9nm)．这说明SNC粒径分布受机械处理条件影响，处理强度越大，SNC的直径越小．

图2 SNC表面形貌(左：SEM，右：AFM)Fig.2 Surface topography of SNC(SEM on left，AFM on right)

2.3 酶解耦合超声破碎

2.3.1 酶解时长的确定

众所周知，纤维素内切酶可以降解纤维素的无定型区[32]，随着酶解时长增加，纤维素酶与底物反应越充分[33]．实验分别探究了酶解3h、10h、24h以及超声破碎对SNC粒径分布的影响，实验结果见图3．随着酶解时间的增长，SNC粒径变小，在酶解3h情况下制得的SNC平均粒径为300nm，酶解24h时减小为220nm．这是由于纤维素酶对纤维素非结晶区和结晶区的水解动力学影响不同[34]，使得酶解反应优先发生在纤维素的非结晶区，有效减小了纤维长度[35].在酶解后进行超声破碎，SNC的粒径显著降低．例如，酶解3h后超声破碎所制备的SNC平均粒径降至100nm．这表明短时间超声破碎即可有效地降低SNC粒径．超声破碎实质上是微气泡的形成、生长和爆破过程．液体中的分子吸收超声波形成气泡，这些气泡迅速炸裂产生能量(10～100kJ/mol)[36]，进一步降低SNC尺寸．

图3 酶解时长以及超声破碎对SNC粒径分布的影响Fig.3 Effects of enzymatic hydrolysis time and sonication on the diameter distribution of SNC

2.3.2 超声破碎时长的确定

如表2所示，在酶解3h条件下考察超声破碎20min、60min、90min和120min对产物粒径以及产率的影响．当超声破碎20min时，制得的SNC直径为80～150nm，产率最低，仅为6.7mg/g；而当超声破碎时间增至120min，SNC粒径大幅度降低至30～80nm，产率也有所提高，为50.6mg/g．结果表明：随着超声破碎时间增长，SNC粒径减小且产率随之提高．

表2 超声破碎时长对SNC粒径和产率的影响Tab.2 Effects of sonication time on particle size and yield of SNC

图4为酶解3h后耦合不同时长的超声破碎所制备SNC的粒径分布，当超声破碎时间由20min增至120min时，SNC粒径分布变窄，峰宽由73.9nm降低至46.1nm，表明延长超声破碎时间可制得更均匀的SNC．综上，随着超声破碎时间增长，制备的球形纳米纤维素粒径减小且粒径分布更均匀，产率也随之提高．

图4 超声破碎时长对SNC粒径分布的影响Fig.4 Effects of sonication time on the diameter distribution of SNC

2.4 酶解联合高压均质

2.4.1 高压均质压力及循环次数的确定

图5为酶解3h后耦合不同条件高压均质所制备的SNC的粒径分布．由图5可见，这种机械处理所得的SNC在1000nm内的粒径分布出现两个峰．如表3所示，在相同循环次数条件下，增加均质压力，SNC颗粒直径大幅度减小，产率增加也很明显．例如，在20MPa(15次)条件下，SNC直径在150～300nm范围内，产率为47.7mg/g；当80MPa(15次)时，制得的SNC减小为10～40nm，产率提升至80.6mg/g．在相同压力下，增加循环次数也有利于SNC粒径减小．例如，20MPa条件下，循环次数从5次提高到15次，获得的纳米颗粒直径从400～800nm减小为70～130nm；但产率变化较小，仅从46.3mg/g提高至48.2mg/g．由于高压均质过程中纤维素受到多种力的作用，包括粒子间的撞击力、剪切力，以及由于物体流速的极端变化而产生的空化力等[37]，降低球形纳米纤维素尺寸．因此，均质压力越大或循环次数越多，SNC粒径越小且产率越高，从收率和能耗角度考虑，本研究选择均质压力为80MPa，循环次数为15次．

图5 高压均质对SNC粒径分布的影响Fig.5 Effects of high-pressure homogenization on the diameter distribution of SNC

表3 高压均质对SNC粒径和产率的影响Tab.3 Effects of high-pressure homogenization on the particle size and yield of SNC

2.4.2 SNC结晶度分析

图6是在均质循环15次情况下制得SNC的XRD谱图，样品的出峰位置几乎无变化，这表明纤维素的晶体保持了天然纤维素Ⅰ型结构；20MPa、50MPa和80MPa条件下均质15次制得的SNC结晶度分别为72.3%、63.9%和58.6%，与原料相比均有提高；但压力越大，结晶度降低．这可能是因为球形纳米纤维素粒径的降低，减少了晶体域之间的氢键[23]；或者是较高压力对剥离非晶态和晶态纤维素的非选择性作用．

图6 均质压力对SNC结晶度的影响Fig.6 Effects of homogeneous pressure on the crystallineity of SNC

3 结 语

本文以成本低廉的木糖渣为原料，采用酶解耦合超声破碎或高压均质的方式制备高附加值的SNC．结果发现碱性过氧化氢处理后的木糖渣结晶度由50.1%提升至74.7%．酶解3h耦合超声破碎120min可得到直径30～80nm的SNC，产率为50.6mg/g；酶解3h联合高压均质，分别在20MPa、50MPa和80MPa压力下循环15次，可获得直径为150～300nm、20～80nm、10～40nm的SNC，收率分别为47.7mg/g、70.1mg/g、80.6mg/g．本研究通过调控制备条件可以得到不同粒径的SNCs(如：5～30nm，10～40nm，30～80nm)，为木糖渣的高效利用以及纳米纤维素的制备提供了一种新思路．