纳豆激酶高产菌株的复合诱变选育

杨子琼，李迪文，赵小斌，刘登辉，张佑红

武汉工程大学环境生态与生物工程学院，湖北 武汉 430205

纳豆激酶（nattokinase，NK）是一种由发酵纳豆中提取的碱性丝氨酸蛋白酶，具有溶栓活性，主要是由纳豆芽孢杆菌产生的［1-2］，可以通过直接溶栓和间接溶栓多种途径对血栓进行降解［3-6］。与链激酶、尿激酶、t-PA等传统的溶栓药物相比，纳豆激酶具有明显的优势，在血栓性疾病治疗中表现溶栓作用效果显著、体内半衰期长、可口服使用、安全性高等优点，在开发成新型预防或治疗血栓性疾病药物具有潜力，对临床治疗血栓性疾病有很高的应用价值［7-9］。

在发酵工业中，优良菌种的选育对发酵产物产量是至关重要的。微生物的诱变育种是菌株选育的主要手段，其优点在于操作简便、方法简单以及效果明显等［10］。Mohana等［11］从土壤异质性微生物种群中分离和筛选出产纳豆激酶的SFN芽孢杆菌，并对其进行了紫外线（ultraviolet light，UV）突变，结果表明紫外线照射是一种有效的诱变剂，可用于改进芽孢杆菌的菌株及增强纳豆激酶活性。甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）作为磺酸脂类烷基化合物，是一种可以使碱基烷基化影响mRNA转录从而导致蛋白质重组的化学诱变剂。杨珠英等［12］使用EMS对竹黄菌悬浮孢子进行诱变处理，筛选得到高产竹红菌甲素菌株10-5，比出发菌株提高46.4%。在用于诱变育种的LiCl、MnSO4等金属盐类中，LiCl常用作助诱剂，因为单一使用LiCl时诱变效果并不明显，但与其他类诱变剂相结合对菌种进行处理时诱变效果显著［13-14］。卢利娜等［15］以紫外线和LiCl复合诱变筛选到枯草芽孢杆菌BL01，获得高产α-淀粉酶突变菌株BL01-13，比出发菌株提高了202%。本研究将结合紫外线、EMS及筛选培养中添加LiCl对高产纳豆激酶菌种进行复合诱变选育。

1 实验部分

1.1 材料与培养基

1.1.1 菌种来源 前期实验室从购买的纳豆食品中筛选出，鉴定并编号为枯草芽孢杆菌XD2［16］。

1.1.2 培养基

初筛培养基：干酪素5 g/L，葡萄糖1 g/L，酵母粉1 g/L，K2HPO41 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO40.1 g/L，LiCl 15 g/L，琼脂粉20 g/L，pH为7.0～7.2。

种子培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH为7.2～7.4。

发酵培养基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨20 g/L，NaH2PO4·2H2O 1 g/L，Na2HPO4·12H2O 2 g/L，MgSO40.5 g/L，CaCl20.2 g/L，pH为7.0～7.2。

1.2 实验方法

1.2.1 出发菌株的生长曲线测定 将保存在LB固体平板培养基上的出发菌株XD2，接入种子培养基中振荡培养（160 r/min、37℃恒温），计时，定时取菌液1 mL，测定其吸光度OD600，绘制出发菌株XD2的生长曲线。

1.2.2 菌悬液的制备 将出发菌株XD2接种到液体种子培养基，然后将其摇瓶培养至对数生长期，取菌液离心，去上清，菌体用无菌生理盐水进行多次冲洗后稀释，制备成菌体细胞均一的出发菌株XD2悬浮液。

1.2.3 菌株的诱变 （1）EMS诱变：取8 mL稀释后的菌悬液，加入2 mL 0.5 mol/L的EMS溶液，EMS处理分别处理0、10、20、30、40、50、60 min（加入等量生理盐水为对照），加入适量质量分数2%的Na2S2O3溶液终止诱变，然后静置，离心、去除上清液。用无菌生理盐水将收集的菌体重复洗涤后，分别将不同EMS处理时间的菌悬液进行梯度稀释，确定最佳稀释梯度后，取0.1 mL菌悬液涂布在LB固体培养基平板上培养过夜，并对菌落个数进行统计，计算致死率。

致死率=（对照组菌落-EMS处理后菌落）/对照组菌落×100%。

（2）紫外线诱变：取10 mL菌悬液和无菌磁力转子放入无菌培养皿中，再放在磁力搅拌器上。在黑暗条件下，使用18 W紫外灯对菌液分别照射0（对照）、30、60、90、120、150、180、210 s，期间保持搅拌使菌液均匀照射，照射完后低温保存2 h，防止光修复。用无菌生理盐水清洗菌体并稀释后，取0.1 mL菌液涂布于LB固体培养基上培养，细数菌落计算其致死率。

致死率=（对照组菌落-紫外照射后菌落）／对照组菌落×100%。

闭环控制中存在着无功优化与电压校正两个模块，控制流程如图1所示，优化与校正的关系如下：①用优化算法可以进行电压校正，但失败情况较多，计算速度较慢，而且动作设备是全网的控制变量，这样从控制的经济性考虑和调度经验考虑都是不可行的。②将优化与校正分离，在电压正常时对全网进行优化，考虑降损并实现逆调压，由于优化实现了逆调压，可以尽量保证电压不越限。③在有电压越限的情况下，启动校正。校正算法在控制区内根据灵敏度选择控制变量进行校正，只需动作几个对越限点影响最大的几个设备，使用基于最小二乘理论的直接校正算法只需几秒钟[5]。

（3）复合诱变：取出发菌株XD2的菌悬液用EMS处理最佳诱变时间，处理后加入适量Na2S2O3溶液终止反应，离心保留菌体，再用无菌生理盐水冲洗。然后将经EMS诱变处理后的菌液转到无菌培养皿中，用18 W紫外灯照射最佳诱变时间。照射完后，将诱变过的菌液适当稀释后，涂布于在含有质量分数1.5%的LiCl作为助诱变剂的初筛培养基上。

1.2.4 菌种的筛选 （1）诱变菌株的初筛：将涂布后的初筛培养基在黑暗条件下37℃恒温培养1 d，观察平板状况，发现长出菌落并表现出生长状态良好后，取饱和硫酸铵溶液滴加在平板上，未分解的干酪素会与饱和硫酸铵溶液反应生成白色沉淀，根据此反应可以观察平板上产生的透明圈，分别测量菌落直径（C，mm）以及菌落产酶形成的透明圈直径（H，mm），并计算透明圈直径与菌落直径的比值（H/C值），用来判断菌株产生的蛋白酶水解蛋白能力的强弱。根据H/C值大小挑选突变菌株进行划线培养获得纯化菌株进行保存。

（2）诱变菌株的复筛：将上述初筛后筛选出的诱变菌株菌落，经种子培养基培养，然后接种到基础发酵培养基中培养。各取发酵液1 mL离心，上清液即为粗酶液。取10µL的上清液滴加在琼脂糖-纤维蛋白平板孔板上在37℃下反应18 h，用数显游标卡尺测量透明圈的直径，与出发菌株XD2的透明圈直径对比，挑选出透明圈直径较大的菌株进行保存。

1.2.5 菌种遗传稳定性 对复筛的6株突变菌株进行传代培养，每隔24 h划线于固体培养基上传一代，连续传代5代，每代接种到发酵培养基中摇瓶发酵48 h。再取10µL发酵上清液点在琼脂糖-纤维蛋白平板上，测量透明圈的平均直径大小，检测其传代稳定性。

1.2.6 纳豆激酶的酶活力测定 纳豆激酶酶活力的测定采用的是琼脂糖-纤维蛋白平板法。称取琼脂糖粉末与纤维蛋白原标准品分别用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）配制成10 mg/mL琼脂糖缓冲溶液和2.5 mg/mL纤维蛋白原缓冲溶液，琼脂糖加热煮沸溶解，待其冷却至45℃，取10 mL琼脂糖缓冲液与5 mL纤维蛋白原缓冲溶液混合均匀，再加入0.1 mL凝血酶溶液（100 IU/mL），快速倒入干净的培养皿中，在水平桌面上室温静置，待其冷却充分凝固为乳白色后打孔备用。取10µL离心后的发酵上清液点在琼脂糖-纤维蛋白平板孔板上，37℃反应18 h，用数显游标卡尺测量透明圈的直径。

1.2.7 尿激酶标准曲线的绘制 将尿激酶标准品用无菌生理盐水分别稀释成50、100、200、400、600、800、1 000 IU/mL的单位浓度梯度，各取10µL加入琼脂糖-纤维蛋白平板的小孔中，在37℃反应18 h，测量透明圈垂直直径（mm），并以垂直直径乘积表示为透明圈的面积S（cm2）。以溶解纤维蛋白的透明圈面积的常数对数lg S为横坐标，以尿激酶酶活力的常数对数lg A为纵坐标，绘制尿激酶标准曲线，得到回归方程。

1.2.8 出发菌株与高产突变菌株的发酵产酶对比将出发菌株和高产突变菌株在相同的摇瓶发酵条件下，定时取样测定菌液的光密度（optical density，OD600）和纳豆激酶酶活力大小进行比较。

2 结果与讨论

2.1 出发菌株的生长曲线绘制

如图1所示，出发菌株XD2的生长周期主要分为4个阶段，从接种开始到3 h，菌体适应生长环境，生长缓慢处于延滞期；从3 h开始，出发菌株XD2快速繁殖，进入对数生长期，菌体以几何倍数增长。12 h后，菌体浓度无明显增长，细胞分裂与死亡达到平衡，生长进入稳定期；培养24 h后，菌体浓度开始下降，培养环境的营养物质耗尽无法提供菌体生长。为制备出发菌株XD2的菌悬液，需要确定菌体处于生长对数期，此阶段菌株正好处于遗传物质为染色质状态，细菌的遗传物质结构更容易改变，并且此时各菌体细胞生长平衡、成分均匀，更有利于突变稳定性。因此确定取培养至12 h时的菌液制备出发菌株的菌悬液。

图1 出发菌株XD2的生长曲线Fig.1 Growth curve of original strain XD2

2.2 诱变剂处理时间对菌种致死率的影响

通常菌体死亡率在85%～90%之间时较容易获得正向突变菌株。如图2（a）所示，在0.1 mol/L EMS浓度作用下，在0～60 min内，致死率随EMS处理时间的增加，菌株的死亡率逐渐上升。到50 min时，菌体致死率到达（97.67±0.92）%，几乎全部死亡。所以为了获得较好的菌株诱变结果，选择0.1 mol/L EMS处理40 min为最佳处理时间，此时致死率为（85.82±2.17）%。如图2（b）所示，紫外的照射时间从30 s延长到120 s时，出发菌株XD2的死亡率由（11.39±1.15）%增长到（85.53±1.69）%；当照射时间达到210 s左右时，致死率可以达到（99.90±0.17）%，意味着此时菌体被杀死几乎没有存活。因此确定在紫外照射时间为120 s，此时致死率为（85.53±1.69）%。

图2 不同诱变剂处理时间对菌体致死率的影响：（a）EMS处理，（b）紫外照射Fig.2 Effect of treatment time with different mutagens on fatality rate of bacteria：（a）EMSprocessing，（b）UV irradiation

2.3 突变菌株的筛选

2.3.1 突变菌株的初筛结果 经过甲基磺酸乙酯和紫外线复合诱变筛选后，从筛选培养基平板中筛选得到H/C值较高的12株突变菌株，其编号分别为YB1-YB6、YC1-YC6，具体的初筛结果如表1所示。

表1 复合诱变菌株的初筛结果Tab.1 Preliminary screening results of compound mutagenic strain

2.3.2 突变菌株的复筛结果 通过摇瓶发酵，复筛结果如表2所示，与出发菌株XD2相比，6株突变菌株在琼脂糖-纤维蛋白原平板上的透明圈直径均增加，说明6株突变菌株的纳豆激酶酶活力均有不同程度提升。其中编号突变菌株YB5的透明圈直径最大达到（30.32±0.13）mm，而H/C值最大的菌株YC4的透明圈直径为（29.11±0.17）mm，小于菌株YB5和菌株YC2，说明H/C值只能相对表现出菌株的产蛋白水解酶的能力。

表2 复合诱变菌株的复筛结果Tab.2 Re-screening results of compound mutagenic strain

2.4 突变菌株的遗传稳定性试验结果

复筛得到的6株突变菌株的传代试验结果如图3所示，经5次传代后，其中突变菌株YB5、YC2、YC5的透明圈直径随着传代代数增加逐渐减小，说明这3株突变菌株遗传稳定性差，产酶性能逐渐衰退；突变菌株YB2、YC4、YC6经5次传代透明圈直径大小趋于稳定；其中菌株YC4的透明圈大小稳定在（29.46±0.09）mm，是6株突变菌株中产纳豆激酶表现最好且遗传稳定性。根据遗传稳定性试验结果确定突变株YC4作为供试株进行后续试验。

图3 突变菌株传代稳定性Fig.3 Subpassage stability of mutant strain

2.5 尿激酶标准曲线

如图4所示，尿激酶标准曲线的线性回归方程为y=4.381 8x-0.162 64，R2=0.992，说明琼脂糖-纤维蛋白平板上的透明圈面积的常数对数lg S与尿激酶酶活力的常数对数lg A成良好线性关系。

图4 尿激酶标准曲线Fig.4 Standard curve of urokinase

纳豆激酶的酶活力X=A×D，其中A为通过回归方程计算的粗酶液中相对尿激酶酶活，单位IU/mL；D为粗酶液的稀释倍数，由于透明圈直径大小在0～24 mm之间的lg S与lg A才有线性关系，超过此范围需要对发酵上清液进行稀释后再上样测定酶活。

2.6 原始菌株与高产突变菌株的发酵产酶比较

如图5所示，突变菌株YC4与原始菌株XD2的生长趋势相似，而突变菌株YC4的纳豆激酶酶活力明显高于原始菌株。在0～12 h阶段，两个菌株均快速生长繁殖，且此阶段产酶水平都很低；12 h后随着菌体的生长进入稳定期，此时两菌株均逐渐开始产酶；18 h开始，原始菌株与突变菌株产酶速度迅速增长；24 h后菌体浓度开始下降进入衰亡期，两个菌株的产酶水平持续增长；至48 h时，两种菌株的纳豆激酶酶活力均达到高峰，此时原始菌株发酵的纳豆激酶酶活力为（3 494.31±149.45）IU/mL，而突变菌株的纳豆激酶活力为（8 450.55±237.40）IU/mL，是原始菌株的2.42倍；发酵48～72 h间，两株菌株的纳豆激酶酶活力均无明显变化。

图5 原始菌株XD2与突变菌株YC4的发酵产酶比较Fig.5 Comparison of fermentation enzymes between original strain XD2 and mutant strain YC4

3 结 论

以前期实验室筛选并保存的纳豆枯草芽孢杆菌XD2为出发菌株，对其进行EMS诱变试验和紫外诱变实验，确定了诱变条件为使用浓度为0.1 mol/L的EMS处理最佳时间为40 min，紫外线最佳照射时间为120 s。通过添加LiCl的初筛培养基筛选到12株蛋白酶的酶解能力较高的菌株，分别编号为YB1-YB6、YC1-YC6。进一步通过摇瓶发酵复筛，筛选到纳豆激酶能力提升的6株菌株，分别是突变菌株YB2、YB5、YC2、YC4、YC5以及YC6。通过传代5代的遗传稳定性试验，最终筛选到突变菌株YC4，其产纳豆激酶能力强且产酶性能稳定。与出发菌株的摇瓶发酵比较，确定突变菌株YC4的产酶发酵周期为48 h，纳豆激酶酶活力为8 450.55 IU/mL，是出发菌株XD2的2.42倍，说明复合诱变效果良好，显著地提高了产酶效益，降低了生产成本，为纳豆激酶的大规模生产提供基础。