干扰素介导肿瘤免疫分子机制的研究进展

马 萍综述 孙圣荣审校

干扰素(Interferons，IFNs)分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，每一型与肿瘤免疫的关系都非常密切，属于抗肿瘤的辅助药物。基于抑制增殖、诱导分化、调节免疫等作用，IFNs及其衍生物已用于肿瘤、病毒感染和神经系统疾病等的辅助免疫治疗上，但其具体机制尚不清楚。免疫治疗已成为肿瘤治疗的研究热点，但是乳腺癌等一些实体肿瘤对免疫治疗并不敏感，其原因可能是肿瘤细胞会通过多种机制躲避免疫系统的识别和冲击。已知的肿瘤免疫逃逸机制包括肿瘤表面抗原的差异、细胞免疫原性较低和在肿瘤微环境中抑制免疫反应等，其中最重要且研究较多的是肿瘤在微环境中的免疫抑制，该机制是通过两种方式实现的：其一是加强免疫抑制细胞的功能，促进抑制因子分泌，降低肿瘤细胞的免疫反应；其二是诱导通路中免疫抑制分子及其受体的表达，发挥免疫抑制作用[1]。因此，研究肿瘤免疫逃逸相关通路的分子机制对攻克肿瘤免疫治疗十分重要。

1 IFNs的分类与结构

IFNs是一类受基因调控的细胞因子，涉及蛋白质和RNA的合成环节。尽管最初IFNs是因其抗病毒活性被发现的，但现在已知IFNs对重要的细胞功能产生了多种影响，如调节免疫、调控细胞周期、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡等，因此IFNs相关物质已用于治疗肿瘤、病毒、神经系统等疾病。根据不同的基因序列、染色体位置和受体差异IFNs可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型[2]。人类有21种IFNs，其中I型16种，包括12种IFN-α及各一种IFN-β、IFN-ε、IFN-κ和IFN-ω；II型1种，IFN-γ；Ⅲ型4种，IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3和IFN-λ4[3]。首先发现的是Ⅰ型IFNs，其编码基因在9号染色体上，I型IFNs的表面受体有两个亚基IFNAR1和IFNAR2；随后逐渐发现Ⅱ型IFNs，其编码基因在12号染色体上；最后发现Ⅲ型IFNs，编码基因在19号染色体上。 IFN-α由165个氨基酸组成，IFN-β由166个氨基酸组成，与IFNα氨基酸同源性为26%-30%，二级结构中有1个二硫键、6个α螺旋和2个β转角，a螺旋是由小片段组成的基本相互平行的长直形。IFN-γ由146个氨基酸组成，二级结构有7个α螺旋，没有β折叠，与Ⅰ型IFNs同源性较低，其活性形式为二聚体结构，并且二聚体的稳定性对维持蛋白质生物活性十分重要。IFN-γ受体的结合在氨基末端残基，羧基端有助于维持IFN-γ的生物活性，因此IFN-γ的氨基端和羧基端的残基对免疫调节不可或缺。Ⅲ型IFN是由较短的α螺旋组成紧凑的束状，结构更类似于IL-10家族的细胞因子IL-22(图1)，因其在粘膜表面抗病毒活性而熟知。

图1 IFNs结构图

IFN-α/β与大多数病毒免疫相关，可通过适应性和先天性免疫系统发挥抗病毒作用；对免疫系统也有一定影响，如IFNs可以抑制一些肿瘤细胞增殖，也可以激活免疫系统中的重要成分如CD8+T细胞和NK细胞，同时促进B细胞和DC细胞的成熟分化；而NK细胞和CD8+T细胞可以抑制肿瘤细胞的转移，因此IFNs可以调节免疫系统从而发挥抗肿瘤作用。免疫治疗是肿瘤治疗的重要措施，IFNs在黑色素瘤细胞、肝癌细胞中的研究较多，但在乳腺癌发生发展及免疫治疗中的作用研究还比较浅显，因此深入探讨IFNs介导的肿瘤免疫相关作用机制，有助于为乳腺癌免疫治疗提供新的方向。

2 IFNs介导肿瘤免疫的分子机制

2.1 Ⅰ型IFNs介导肿瘤免疫的分子机制

Ⅰ型IFNs的抗肿瘤机制主要体现在以下几个方面，即对免疫反应的调控，抗血管生成，抑制肿瘤细胞增殖、分化和迁移，加速其凋亡等。具体机制如下：(1)在免疫调控方面，干扰素激活蛋白(Stimulator of Interferon Genes ,STING)途径可产生IFNs，当细胞质内的DNA与522个氨基酸结合形成环鸟腺苷酸合成酶(Cyclic GMP-AMP Synthase, cGAS)后激活并催化ATP和GTP合成第二信使环二核苷酸2，3，-cGAMP，二聚化的STING与cGAMP通过自噬小体磷酸化后与干扰素调节因子3(Interferon Regulatory Factors 3，IRF3)结合，STING、cGAMP和IRF3复合体磷酸化后进入细胞核，诱导干扰素表达(图2)[4]。生成的IFNs可以促进DC细胞呈递抗原，增加细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Lymphocyte,CTL)的功能，同时Ⅰ型IFNs可以进一步激活cGAS-cGAMP-STING信号通路，刺激产生趋化因子招募效应T细胞在微环境中杀伤肿瘤细胞。(2)在抗血管生成作用中，IFNβ 通过抑制肿瘤相关中性粒细胞的聚集[5]而抑制血管生成因子的表达，达到抑制血管生成的作用。(3)在促进细胞凋亡方面，主要通过两条途径，一条激活细胞表面的死亡受体，另一条激活线粒体释放细胞色素C诱导激活凋亡蛋白酶级联反应。IFNα诱导的细胞凋亡的关键步骤是激活凋亡蛋白酶2、3、8和9。

图2 cGAS-cGAMP-STING信号通路

研究发现IFN激活促进具有凋亡作用的Bak和Bax基因，并使其转移到线粒体[6]中，促使线粒体丧失膜电位并释放细胞色素C，后者激活凋亡蛋白酶9从而共同形成凋亡复合体，促进细胞凋亡。在乳腺癌中IFN可上调凋亡蛋白酶8的表达，发挥其促凋亡作[7, 8]。IFNs还可通过促进CD8+T细胞组织相容复合物MHC1和CD4+T细胞MHC2的活性，上调肿瘤细胞表面抗原表达使其更易被机体免疫系统识别，并激活DC细胞使其向T细胞交叉呈递肿瘤抗原，加强CD8+T细胞的免疫功能[9]；IFNs还能提高免疫蛋白酶体的活性，使其和MHC相互作用识别并杀伤肿瘤细胞，促进局部免疫反应，加速肿瘤细胞死亡并抑制其生长；IFNs也可以提高NK细胞的毒性作用直接杀伤肿瘤细胞，如结直肠癌中NK细胞介导的IFN通过白介素-15(IL-15)促进机体免疫抑制肿瘤生长[10]。相关研究表明，肿瘤浸润中性粒细胞会产生更多的促血管生成因子，而IFN-β会抑制肿瘤相关中性粒细胞的聚集[5]，通过抑制肿瘤血管生成来抑制细胞增殖。

IFNs在体内发挥抗肿瘤作用有两条重要的信号通路，其一是JAK-STAT通路，当IFN-α与细胞表面的受体结合时诱导酪氨酸磷酸化并激活STAT蛋白上的非受体酪氨酸激酶JAKs和酪氨酸激酶TYK2，形成STAT的结合位点，并转移到IRF1上，与IFN-α受体亚单位IFNAR1和IFNAR2的胞质域结合后诱导STAT1和STAT2的酪氨酸磷酸化，形成同源和异源二聚体转移到细胞核内与干扰素刺激基因(Interferon-stimulated Genes,ISGs)启动子中特定的DNA序列结合，通过调控一系列基因的转录，引发下游效应[11](图3)，通路中的转录因子STAT1可以通过调节肿瘤坏死因子TNFα诱导细胞凋亡。其中下游基因IRF是IFNs家族的一员，在许多肿瘤中发挥重要作用，且作用不尽相同，如在肝细胞癌中IRF2显著降低PD-L1的表达，对克服PD1/PD-L1免疫检查点相关的免疫逃逸意义重大[12]；在胃癌中IFR2高表达可以提高免疫治疗的疗效[13]；IRF1还可以抑制骨肉瘤的侵袭转移[14]；在乳腺癌细胞系中，IFNs诱导IRF1的过表达能够促进乳腺癌细胞凋亡[15]，抑制肿瘤发生发展[16]。IRF也有负性作用，IRF2与直肠癌肝转移有关[17]，还可促进多发性骨髓瘤细胞增殖。综上JAK-STAT通路调节多种细胞信号，影响基因表达并在细胞增殖、分化、转移、血管生成和免疫调节中起着至关重要的作用[18]。其二是PI3K-AKT-mTOR通路，IFNs通过促进磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)脂质化和调节丝氨酸激酶的活性，激活通路的上游信号，进一步影响细胞内核糖体和其它蛋白质的翻译来调节细胞增殖和生长(图4)。研究表明，蛋白激酶B即AKT通过磷酸化参与细胞凋亡的几种成分来调节细胞生存，如促凋亡的BAD基因、小鼠双分子同源物2(Mouse Double Minute 2 Homolog,MDM2)和凋亡蛋白酶9等。BAD的磷酸化抑制了其与抗凋亡的Bcl结合，并恢复Bcl的抗凋亡功能，从而抑制细胞凋亡。MDM2作为致癌基因与抑癌因子p53结合，并通过蛋白酶体促进其降解,MDM2被AKT磷酸化后，有利于进入细胞核促进p53的降解。此外，AKT磷酸化凋亡蛋白酶9抑制其催化功能，使其失活从而抑制细胞凋亡。AKT还可阻断叉头框蛋白(Forkhead Box O,FoxO)介导的多种蛋白的转录来促进细胞周期，如Fas配体FasL、p27和p21等[19, 20]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR因子与恶性肿瘤息息相关，其在细胞生存、细胞骨架重排、侵袭、转移、抗凋亡和内分泌等方面均发挥着重要作用。mTOR在多种癌症中过度表达，其原因首先是上游信号通路RTKs/PI3K/Akt的过度激活，其次是与mTOR密切相关的信号失调，如负性调控因子TSC1/2、小GTP酶超家族Rheb和p70S6K/4EBP1等，再次是mTOR自身在癌症中有基因失调的现象，包括扩增、下调及突变等。目前mTOR抑制剂在恶性肿瘤中通常被用作免疫抑制剂[21]，如依维莫司，用于治疗胰腺来源的神经内分泌肿瘤、乳腺癌、肾癌等。该通路在很多癌症中过度激活，尤其在乳腺癌中，以PIK过度激活最为常见[22]，该通路的过度激活会促进细胞的转化、肿瘤的发生发展及对细胞凋亡的抵抗，从而出现肿瘤的侵袭转移和耐药。IFNs作为一种细胞因子可激活该通路并上调PI3K和mTOR等下游信号分子，促进癌症发生发展、侵袭转移，故IFNs与肿瘤免疫耐受及逃逸相关。

图3 JAK-STAT信号通路

图4 PI3K-AKT-mTOR信号通路

2.2 Ⅱ型IFNs介导肿瘤免疫的分子机制

IFNⅡ也被称为IFN-γ，由活化的T细胞，NK细胞和NKT细胞产生，称为免疫性IFNs，它与IFN-γ受体IFNGR复合物结合，介导对非病毒性病原体的广泛免疫反应，对外来的抗原和有丝分裂原产生反应，在免疫反应的效应阶段发挥重要作用。IFN-γ同样激活JAK-STAT信号通路将信号传递至细胞核内[23],通过调控一系列基因的表达如肿瘤抑制基因IRF1和IRF9、抑制增殖基因STAT、促细胞凋亡基因IFITM2，以及天然免疫调控基因IFI35等[24]调控免疫反应，如在乳腺癌中，IFN-γ通过该信号通路，调控STAT蛋白的活化，而STAT蛋白可抑制乳腺癌细胞的增殖分化，但同时也可以上调肿瘤细胞表面PD-L1的表达，促进肿瘤细胞免疫逃逸，所以IFN-γ对乳腺癌免疫有双重作用，哪种作用占优势可能取决于暴露的IFN-γ浓度。

2.2.1 IFN-γ的抗肿瘤免疫: IFN-γ能够加强T细胞、 巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等免疫细胞的功能，辅助抗肿瘤免疫反应[25]，在肿瘤微环境中激活细胞免疫进而发挥抗肿瘤免疫效应。IFN-γ可以促进趋化因子的产生及免疫细胞的募集，同时促进Th1细胞的分化、诱导CTL细胞的成熟和巨噬细胞的活化[26]，还可抑制具有促瘤作用的免疫细胞Th2、Th17以及调节型T细胞(Regulatory T Cells，Treg)的分化成熟[27]，进而调节肿瘤微环境中的先天性和适应性免疫,产生持续的抗肿瘤免疫反应。

IFN-γ可以激活Fas/FasL通路，该通路与免疫疾病发生发展密切相关，Fas是一种细胞凋亡信号受体，可促进细胞的凋亡。在乳腺癌中，IFN-γ可以通过Fas/FasL通路促使细胞凋亡，抑制乳腺癌细胞的增殖[28]，同时Fas信号传导也可以促进CD8+T淋巴细胞产生IFN-γ发挥调节肿瘤免疫的作用[29]。除了激活上述通路外，IFN-γ还可以在肿瘤微环境中对肿瘤细胞进行调控，如调控细胞周期，影响肿瘤细胞的增殖。IFN-γ也可以通过激活凋亡蛋白酶2、3、8和9加速肿瘤细胞的凋亡，在微环境的免疫反应中IFN-γ可分泌免疫因子抑制肿瘤的血管生成[7]。IFN-γ可以使乳腺上皮细胞MCF-10细胞系高表达趋化因子受体CXCL17，招募DC细胞和巨噬细胞调控免疫，从而抑制乳腺癌细胞的增殖分化[30]；基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase ,MMPs)能破坏细胞间的屏障来促进肿瘤转移，而IFN-γ能抑制MMPs的活性从而阻止肿瘤细胞发生转移[31]。

2.2.2 IFN-γ的促肿瘤免疫：很多肿瘤都会过度激活丝氨酸同源酪氨酸磷酸酶2(Serine Homologous Tyrosine Phosphatase，SHP2)，并诱导IFN-γ通路发生免疫逃逸，如乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌和口腔癌等[32]。SHP2或细胞因子信号抑制物(Suppressor of Cytokine Signaling ,SOCSs)过度激活时,会促进肿瘤细胞激活IFN-γ通路从而进行逃逸。IFN-γ还通过激活PD-L1、CTL4、IDO1、MHCⅡ反式激活因子等免疫逃逸基因，促进肿瘤免疫逃逸[33]。乳腺癌髓系来源的抑制细胞可以通过IFN-γ激活JAK-STAT通路，其下游的IRF9与STAT1-STAT2复合体合成干扰素刺激因子3(Interferon-Stimulating Factor,ISGF3),ISGF3与STAT2形成二聚体转位到细胞核中，并结合吲哚胺2,3-双加氧酶IDO基因启动子上的IFN-γ激活序列[15]，IDO具有促进癌症发生和恶化的作用，从而激活IFN-γ的转录发挥免疫抑制作用，促进乳腺癌的发生；此外，分析TCGA数据库得出JAK-STAT途径通过IFN-γ主要参与PD-L1的表达，免疫组化也表明IFN-γ介导JAK-STAT通路显著上调PD-L1，并且STAT1高表达者PD-L1升高更显著，IFN-γ也能诱导间质细胞表达PD-L1，当肿瘤细胞PD-L1与T细胞表面的PD-1结合后，抑制T细胞的功能与效应达到免疫抑制作用，这是PD-1/PD-L1抑制剂治疗出现耐药的重要原因[34]。在黑色素瘤中，IFN-γ可上调肿瘤细胞CTL相关蛋白的表达, 抑制T淋巴细胞活化，实现肿瘤免疫逃逸，也可以通过诱导ID0的表达激活Treg细胞并抑制CTL的活性。IFN-γ还可以通过蛋白激酶磷酸化的自噬途径增加乳腺上皮细胞的恶性转化。

2.3 Ⅲ型IFNs介导肿瘤免疫的分子机制

IFNⅢ包含IFN-λ1(也称为IL29)、IFN-λ2(IL28A)、IFN-λ3 (IL28B)和IFN-λ4亚型。IFN-λ能减少Th2型细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13、IL-14、IL-15)的产生，增加Th1相关免疫途径的效应，增加调节性T细胞和CD8+T细胞的功能，而肿瘤细胞中的Th1和CD8+T淋巴细胞能抑制肿瘤血管生成从而抑制肿瘤增殖，因此IFN-λ是调控微环境中的细胞因子而发挥肿瘤免疫作用的。IFN-λ受体由IL28Rα和IL10Rβ两条链组成，其IL28Rα受体只在胃肠道、生殖道上皮细胞和一些特定的免疫细胞上表达[35]，其特异性非常高。IFN-λ的抗肿瘤作用体现在：抑制细胞增殖，改变细胞周期和诱导细胞凋亡，同时可以增加肿瘤细胞Fc受体表达以及HLAⅡ类抗原表达，增加肿瘤细胞免疫原性，促进局部免疫反应，抑制肿瘤的发生发展。

3 IFNs的临床应用

免疫治疗是肿瘤的突破性进展，IFNs属于一种抗肿瘤免疫药物，其在肿瘤内的水平与乳腺癌、肺癌和黑色素瘤等多种肿瘤预后相关。在肾细胞癌中HERVs病毒通过激活IFN信号通路发挥抗肿瘤免疫作用[36]。在黑色素瘤中，视黄酸诱导基因I诱导IFN-α和IFN-β激活JAK-STAT通路发挥强大的抗肿瘤作用[37]。在胰腺癌中IFN-α和IFN-γ也通过免疫调节发挥抗肿瘤作用[38]。在肝细胞癌中，IFN-γ激活JAK-STAT通路诱导下游抑癌基因IRF2过表达，从而下调PD-L1，因此在肝细胞癌中通过调控IFN-γ通路抑制了肿瘤免疫逃逸而发挥抗肿瘤作用[12]。在肺腺癌细胞中，IFN-γ诱导激活JAK2-STAT1和PI3K-AKT途径，激活JAK2-STAT1通路主要起抗增殖作用，而PI3K-AKT途径上调PD-L1的表达促进免疫逃逸，PI3K抑制剂阿培利司可下调PD-L1的表达，并增强IFN-γ的抗增殖作用，表明阻断PI3K可能使IFN-γ介导的抗肿瘤作用最大化[39]，目前阿培利司还处于治疗肺癌的各期临床研究阶段。近期IFN-γ对乳腺癌免疫治疗的相关研究也如火如荼的进行，其既可以调节免疫促进凋亡，又可以通过各种机制促进乳腺癌细胞的免疫逃逸，并且有望攻克PD-1/PD-L1抑制剂治疗出现耐药的现象，在乳腺癌中，肿瘤抑制性转录因子(Elf5)的缺失可激活IFN-γ介导的JAK-STAT信号通路，促进PD-L1的表达，同时招募免疫抑制中性粒细胞聚集，促进肿瘤免疫逃逸[40]；IFNs也可激活PI3K-AKT-mTOR信号通路，以PIK过度激活最常见，促进乳腺癌细胞的转化、肿瘤的发生发展及对细胞凋亡的抵抗，从而出现肿瘤的侵袭转移和耐药，目前临床上PI3K抑制剂阿培利司联合氟维司群已用于乳腺癌的治疗。在类风湿关节炎，骨硬化病，肺纤维化，肝纤维化等疾病中也均产生可观的疗效。虽然临床上可以注射重组人IFNs来提高其瘤内水平，但其靶向性及疗效差，全身免疫毒性反应也较重；并且瘤内IFNs的上调不可避免地诱导多种免疫检查点分子表达，使肿瘤发生免疫逃逸产生免疫耐受。针对以上问题张鹏和李亚平团队利用基因工程获得表观遗传调控纳米囊泡(OPEN)，动物模型静脉注射后，OPEN可特异性靶向肿瘤，高效诱导瘤内IFNs分泌，上调肿瘤细胞PD-L1和主要组织相容性复合体MHC-1等表达，显著提高细胞毒性T细胞在肿瘤中的浸润，有效抑制乳腺癌、结肠癌和黑色素瘤的生长[41]。该研究开拓了克服免疫耐受、改善肿瘤免疫治疗的新方向，为加强IFNs的抗癌活性和降低免疫逃逸提供了新思路。

4 小 结

免疫治疗是抗肿瘤的有效方式，但肿瘤的特殊性较易产生免疫逃逸，肿瘤细胞可通过各种机制逃避免疫系统的识别和攻击，但具体机制尚未完全明了，因此探究肿瘤免疫意义深远，本文阐述了IFNs相关的抗肿瘤和促肿瘤免疫机制。IFNs相关研究越来越广泛，从抗病毒延伸至抗肿瘤，都发现其强大的生物学活性。一方面IFNs可以延长细胞周期，降低肿瘤细胞浸润性，抑制血管生成，调节肿瘤微环境，增强巨噬细胞等的免疫监视，加速肿瘤细胞凋亡；另一方面IFNs也可以通过激活相关免疫逃逸基因如PD-L1等，促进肿瘤细胞免疫逃逸。虽然临床上可以注射重组人IFNs来提高其瘤内水平，但其靶向性及疗效差，全身免疫毒性反应也较重；并且瘤内IFNs的上调又可诱导多种免疫检查点分子表达，使肿瘤发生免疫逃逸产生免疫耐受，所以很多肿瘤的IFNs药物治疗还在临床实验阶段。IFNs通过不同途径发挥作用，有望攻克PD-1/PD-L1抑制剂治疗出现的耐药，为免疫治疗提供了新方向。

◀