右美托咪定对左向右分流型先天性心脏病大鼠心脏功能与认知功能的影响*

刘新燕 周佩佩 马漫漫 李东兴 侯俊德 韩银锋

左向右分流型心脏病，亦称“非紫绀型先天性心脏病”，患儿一般都会出现呼吸困难、心律失常和肺功能异常，严重影响身体健康。其常见病变为房间隔缺损、室间隔缺损和动脉导管未闭，分别占先天性心脏病约10-20%、12-20%、12-15%[1]，可引起心脏负荷加重、肺动脉高压、肺血管重构，其中以肺动脉高压较严重，随着肺动脉平均压升高，右心室压力逐渐增加，最终导致右心室衰竭[2，3]。外科手术干预是目前治疗左向右分流型心脏病的主要方法，但是手术麻醉剂的使用，会影响患儿生长发育和认知功能[4]。右美托咪定是一种选择性肾上腺素能受体激动剂，除作为外科手术常用镇静剂和辅助剂以及重症监护镇定剂[5]外，近些年研究表明它还具有保护神经元、抗炎及保护心脏功能等作用[6，7]，因而受到临床关注。本文通过左向右分流型先天性心脏病大鼠模型观察右美托咪定对模型大鼠生长发育、心脏功能及认知功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组处理

6周龄SPF级雄性SD大鼠30只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，体重(200±10)g，实验动物许可证号：SCXK(京)2019-0010。采用随机数字表法将大鼠随机分为正常对照组(n=6)、模型组(n=12)和模型干预组(n=12)。模型组和模型干预组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(70mg/kg)麻醉后行套管法右颈总动脉-颈外静脉分流术，建立左向右分流型先天性心脏病大鼠模型：麻醉大鼠颈部正中纵向切口，长度为下颌骨下缘至胸骨上方，暴露右颈外静脉，于远心端结扎并切断，近心端穿线备用。分离颈总动脉，穿线远心端并结扎，血管钳夹住近心端，在远心端结扎线以下约0.5cm处切断。颈总动脉游离端穿过套管，并使其内膜翻转套在套管上，结扎固定，而近心端套在翻转的颈总动脉上，结扎固定， 此时松开血管钳， 见血管搏动明显即为造模成功[8]，两组大鼠均造模成功。正常对照组大鼠同法麻醉后仅游离右侧颈总动脉及颈外静脉，不进行其它手术操作。模型干预组大鼠手术麻醉时腹腔注射右美托咪定(100mg/kg)1次，术后每3天一次，剂量同前，共干预6周。正常对照组和模型组平行注射等量生理盐水。术毕切口涂抹青霉素粉预防感染，缝合切口，苏醒后按组别分笼饲养，三组大鼠的饲养条件完全相同：常规饲喂普通饲料、自由饮食进水，光照昼夜节律明暗各12h(早6点至晚6点)，室温(22±2)℃，并保持安静。实验过程中无大鼠死亡。

CT技术检测出552枚淋巴结，188枚淋巴结为良性，其中病理证实为良性者139枚，恶性者49枚，CT技术检测出364枚为恶性，其中病理证实为良性者63枚，恶性者301枚。统计检测所得数据，并对结果进行分析，具体统计情况见表3。

术后第1周至第6周，每周用电子计数天平(上海恒平电子天平YP20KN)称量、记录一次体重(g)。第2、4、6周末各进行一次Morris水迷宫实验。第6周末腹腔注射戊巴比妥钠(70mg/kg)麻醉后行超声检查心功能，之后断头处死各组大鼠。对大鼠心脏采血检测炎性指标和心肌损伤指标，并立即摘取大脑和心脏，组织学观察海马神经元细胞损伤和心肌纤维；同时检测海马和心肌组织的炎性细胞因子表达水平。

羊群感染布鲁氏杆菌病后症状不明显，因此，极易与其他传染病混淆，养殖户也未对其给予足够的重视和关注。母羊感染此类传染性疾病后容易出现流产现象，通常流产时间为妊娠后3个月或4个月，在流产前并没有明显的症状，即使诱发病症，多数情况也是患有关节炎或者乳房炎。公羊感染此类疾病后会与公牛一样引发附睾炎或者睾丸炎。

1.2 Morris水迷宫试验观察大鼠逃避潜伏时间

自制试验装置包括圆形恒温水池(直径120cm、水深50cm)、水下平台(直径10cm、高49cm)。将水池分为四个象限，每个象限用不同颜色贴纸作为标记，水池温度控制在25±1℃。术前4天开始训练，每天四个象限各训练4次。第一次训练时潜伏平台放在第一象限内，将大鼠置于平台上停留15s进行适应(之后每天各象限训练不再重复此动作)。依次从四个象限将大鼠放入水中，若大鼠在60s内找到平台并停留超过3s判定为寻台成功，记录大鼠从入水到寻台成功的时间(逃避潜伏时间)，若大鼠在60s内不能找到平台，则由实验人员将其引导至潜伏平台，记录逃避潜伏时间60s。术后第2、4、6周末对各组大鼠同术前训练方法进行Morris水迷宫试验，记录逃避潜伏时间。

分析师建议：从目前的养殖环境来看，养羊成本是增加的，一方面，人工增加，另一方面，随着环保部门对自然资源的保护力度加大，要求退牧还草，从以前的散养型转变到现在的圈养型，让羊肉的生产成本逐年增加，间接促成了羊价的上涨。虽然现在市场行情较好，但养殖户一定不能盲目扩养。盲目扩养会导致整羊增多，有可能会使羊肉卖不上好价格。养殖户在养殖的过程中一定要科学养殖，在销路、深加工上下功夫。（信息来源：央广网）

1.3 超声心动图检测大鼠心功能指标

麻醉后大鼠采用小动物超声成像系统(型号Vevo770，加拿大Visualsonics公司)，按常规操作，检测各组大鼠心功能，考虑到右心室功能变化是左向右分流型先天性心脏病与心肌纤维化的共同病理变化，选取右室舒张末期前后径(RVEDD)、右室前壁舒张末期厚度(RVWTd)、室间隔舒张末期厚度(IVSd)三指标进行观察分析。

三组大鼠术后逃避潜伏时间差异有统计学意义(P<0.01)。模型组大鼠术后2、4、6周末的逃避潜伏时间相比正常对照组显著延长(t值分别为4.137，3.458，2.278，P<0.05)，而模型干预组较模型组显著缩短(t值分别为3.144，2.767，2.160，均P<0.05)，见表1。

1.4 ELISA检测大鼠血清炎性指标和心肌损伤指标

各组大鼠第6周末体重均较试验前明显增加，其中正常对照组增至262.12±9.38g,模型组增至223.28±7.15g，模型干预组增至240.52±8.09g，三组实验6周末体重差异有统计学意义(F=48.341，P<0.01)；两两比较，模型组低于正常对照组(t=9.815，P<0.01)，模型干预组高于模型组(t=5.531，P<0.01)。

随着人们生活水平的提升，对富含特色的产品更加追求，对此富含传统居民元素的艺术文化产品、作品更被市场看好。传统居民元素利用乡土文化气息这一文化特征，可提高人们的舒适度。在陶瓷艺术设计中的应用，可以突显作品返璞归真的文化特征。不仅对传统民族文化有传承作用，同时也拓展了传统文化的传播途径，间接带动了陶瓷设计作品的特色发展。传统民居元素的设计，强调与自然环境和谐相处，围绕自然生态理念，将陶瓷艺术设计作品回归到自然生态的本源。传统居民元素在现代建筑中的应用另类感强，对此其文化功用在建筑中难以有效体现。在陶瓷艺术设计中的应用，将自然观等生态文化充分体现，侧面烘托出了设计者的思想、人文情怀。

1.5 HE染色和Masson染色观察大鼠海马、神经元和心肌纤维化

HE染色显示，术后6周末正常对照组大鼠海马区神经元细胞排列整齐规则、致密有序，形态、大小正常，核清晰可见，且分布规则；模型组神经元细胞出现排列无规则、细胞结构不清晰、细胞密度显著下降等病理损伤现象；模型干预组神经元细胞上述变化较模型组减轻。见图1。

1.6 Western blotting检测大鼠海马、心脏炎性因子蛋白表达

将大鼠大脑海马及右心室用RIPA裂解液进行裂解，30min后蛋白洗脱，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号：abs9232)检测总蛋白浓度(25mg/ml)。SDS-PAGE电泳、转膜。一抗(1∶1 000)孵育，将PVDF膜蛋白面朝下放于抗体液面上4℃过夜；二抗(1∶200)孵育，将PVDF膜蛋白面朝下放于二抗液面上室温孵育2h。化学曝光、显影。美国Chemilmager 5500型凝胶成像仪照像后，用Image J软件分析电泳条带灰度，以GAPDH作为内参。用灰度比值(目的蛋白灰度/内参灰度)表示目的蛋白表达量。比值越大，目的蛋白的表达水平越高，反之亦然。抗大鼠GAPDH、IL-1β、IL-6、TNF-α一抗及二抗均购于美国Abcam公司(批号：400-31、E-20533、BA0992、BA0131)。

1.7 统计学处理

ELISA结果显示，三组大鼠炎性指标IL-1β、IL-6、TNF-α差异均有统计学意义(均P<0.01)。相比于正常对照组，模型组显著升高(t值分别为5.801，5.461，7.487，均P<0.01)，而模型干预组显著低于模型组(t值分别为3.338，3.374，3.745，均P<0.01)。见表4。

2 结 果

2.1 各组大鼠体重比较

断头处死大鼠后心脏取血3ml，室温2 500r/min离心15min，分离血清。采用ELISA检测白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-a(TNF-α)、氨基端前B型钠尿肽(NT-proBNP)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白(cTnI)水平，具体方法参照试剂盒说明书。IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA试剂盒购于美国R&D System公司(批号：110810、210603、330244)；NT-proBNP、CK-MB、cTnI ELISA试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司(批号：2400162、M25082、20161101)。

2.2 各组大鼠逃避潜伏时间比较

当电感L和电池的等效电阻r不可忽略时，只需将上式中sL项相应变化，再对其进行求解，即推导出非理想情况下Boost电路的开环输出阻抗Zoo（s）：

表1 各组大鼠术后逃避潜伏时间比较

2.3 各组大鼠部分心功能指标比较

Masson染色显示，正常对照组大鼠右心室胶原纤维散在分布或呈条索状；模型组大鼠右心室心肌明显纤维化，表现为胶原纤维粗大且交织或堆积成片状，沉积增多；模型干预组心肌纤维化较模型组减轻。见图2。

表2 右美托咪定对左向右分流型先天性心脏病大鼠部分心功能指标的影响

2.4 各组大鼠心肌损伤指标比较

三组大鼠心肌损伤各指标组间差异有统计学意义(P<0.01)。相比于正常对照组，模型组大鼠血清NT-proBNP、CK-MB、cTnI水平显著升高(t值分别为8.881，7.519，8.228，均P<0.01)，模型干预组大鼠显著低于模型组(t值分别为3.284，3.011，3.000，均P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠部分心肌损伤指标比较

2.5 各组大鼠海马神经元病理变化

各组大鼠大脑海马及心脏组织采用10%福尔马林溶液固定24h，然后按常规方法脱水，包埋、切片，分别按照所购试剂盒常规方法进行HE染色和改良Masson染色。海马神经元HE染色后，镜下观察神经元的胶核显出蓝色，其它染成红色。心脏组织Masson染色后镜下观察心肌的胞核呈蓝黑色，胶质纤维呈蓝色，其它呈红色。

图1 各组大鼠海马神经元组织病理变化(HE染色，×200)

2.6 各组大鼠心肌纤维化

三组大鼠心功能各指标差异有统计学意义(P<0.01)。相比于正常对照组，模型组大鼠的RVEDD、RVWTd、IVSd水平显著增加(t值分别为11.429，12.571，10.286，均P<0.01)，而模型干预组较模型组显著改善(t值分别为4.899，4.648，4.648，均P<0.01)。见表2。

图2 各组大鼠右心室心肌纤维化(Masson染色，×200)

2.7 各组大鼠血清、海马及心肌组织炎性因子水平比较

表4 各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平变化

Western blotting结果显示，三组大鼠海马组织中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达(F值分别为87.444，39.338，52.597，均P<0.01)与心肌组织中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达的差异有统计学意义(F值分别为38.339，18.991，8.335，均P<0.01)。模型组海马组织中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达(t值分别为11.292，7.685，9.352，均P<0.01)及心肌组织中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平(t值分别为6.722，5.810，38.563，均P<0.01)较正常对照组显著升高，而模型干预组较模型组显著降低(海马组织：t值分别为7.731，9.153，4.038，均P<0.01；心肌组织：t值分别为6.049，2.152，4.070，均P<0.05)。见图3。

两组患者术后均于24 h内控制排便，术后5～7 d常规应用抗生素抗感染，观察切口变化，进行对症、支持治疗，同时保持切口干净、干燥，每天换药1次，术后7～10 d拆线。

注：A、B分别为海马组织IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白电泳图和电泳条带灰度比值直方图；C、D分别为心肌组织IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白电泳图和电泳条带灰度比值直方图；与正常对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

3 讨 论

左向右分流型先天性心脏病患儿随着病情发展，会出现认知功能衰退，表现为注意力不集中、记忆力减退；此外，由于心脏负荷加重、肺血管重构，容易导致肺动脉高压的发生，引发心力衰竭。临床外科手术是根治左向右分流型先天性心脏病的主要方法，但手术麻醉会影响患儿生长发育和认知功能，是患儿手术后的常见并发症，因而成为临床麻醉科的研究重点。右美托咪定是外科手术常用的镇静剂和麻醉辅助剂。已有研究表明右美托咪定具有镇定作用和抑制神经元细胞凋亡作用[9]，本研究中发现，右美托咪定干预左向右分流型心脏病能够使模型大鼠体重增加，即可能促进模型大鼠的生长发育[10]，同时明显提高模型大鼠的空间学习记忆能力，显著逆转海马组织中神经元细胞损伤，以及有效改善模型大鼠心功能和心肌纤维化。进一步检测发现，左向右分流型先天性心脏病模型大鼠血清心肌及海马、组织处于高炎症状态，表现为IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，而经过右美托咪定干预，模型大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低。提示右美托咪定上述功效可能通过抑制相关炎症而得以实现。

有研究认为[11，12]，手术创伤、脏器再灌注损伤等可诱发左向右分流型先天性心脏病氧化应激和炎症反应，使血清IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子分泌增加，同时促进炎性细胞渗出；炎性细胞产生的花生四烯酸在各种相关酶类的作用下生成白三烯、前列腺素等具有促进心肌纤维化介质，激活心肌纤维化通路，造成心肌纤维化[13]。而右美托咪定可通过激活中枢α2受体来抑制交感神经活性，减少儿茶酚胺释放，抑制去甲肾上腺素诱导的炎性因子RNA表达，同时减少巨噬细胞和单核细胞释放炎性因子，减轻炎症反应，从而抑制心肌纤维化，减轻心功能损伤[14]。还有研究报道，左向右分流型先天性心脏病产生的大量炎性因子也会对中枢神经系统神经元造成损害，影响脑组织代谢及认知功能。采用右美托咪定可降低交感神经兴奋性，抑制神经系统小胶质细胞分泌炎症介质，减轻活性氧、神经毒素对神经元的损伤，并通过抑制细胞凋亡、促进神经元细胞对谷氨酸摄取等途径保护神经元，从而改善认知功能[15]。此外，右美托咪定还可起到稳定血流动力学以及通过对磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路、NLRP3/Caspase-1通路的调控作用发挥神经元保护及脑保护作用，协同改善认知功能。

综上，右美托咪定可显著改善左向右分流型先天性心脏病大鼠心脏功能、认知功能和炎症反应，验证了其在防治左向右分流型心脏病中的作用。

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