羧基功能化磁性碳纳米管的制备及其对猪肉中瘦肉精的萃取

连丽丽，陈柏森，邓艺辉，王希越，张凌赫，娄大伟

（吉林化工学院 分析化学系，吉林 吉林 132022）

自20世纪80年代以来，盐酸克伦特罗（CLB）和莱克多巴胺（RAC）等肾上腺素受体激动剂被广泛用作牲畜食品添加剂，以减少被饲养动物的脂肪、提高其肌肉生长，因此也被称为“瘦肉精”［1-3］。“瘦肉精”可在动物组织中累积，人类食用被其污染的肉类后会引起疲惫、头晕发烧、心律失常和新陈代谢紊乱等不良反应，严重者会引发癌症、中枢神经和心血管疾病［4］。因此，我国及许多国家已禁止使用“瘦肉精”作为动物生长促进剂［5］。然而，由于其成本低廉、作用高效，“瘦肉精”作为饲料添加剂仍屡禁不止。因此，开发复杂样品中“瘦肉精”的检测方法具有重要意义。

固相萃取（SPE）技术作为最常用的样品净化和预富集步骤，结合仪器分析，能够实现复杂基质中痕量组分的准确分析［6］。近年来，在SPE 基础上发展起来的磁性固相萃取（MSPE）技术，作为一种新型样品前处理手段受到了广泛关注［7］。MSPE技术的关键在于制备对目标分析物具有良好吸附性能的磁性吸附剂。Fe3O4、γ-Fe2O3等磁性纳米粒子（NPs）具有较小的尺寸、优异的磁响应性，在其表面进一步修饰多功能基团得到的磁性杂化材料可作为MSPE吸附剂。碳纳米管是一维线性结构的纳米碳材料，可分为单壁碳纳米管和多壁碳纳米管（CNT），具有比表面积大、易于功能化修饰、性质稳定等优点［8］。将其与Fe3O4、γ-Fe2O3等磁性NPs相结合构建的磁性碳纳米管兼具二者优点，不但具有良好的磁性，而且具有较高的吸附容量，被广泛应用于环境水、食品、生物样品中兽药［9］、雌激素［10］、多环芳烃［11］、农药［12］和染料［13］的富集与分离。

本文在超声辅助下，通过氧化-沉淀法合成了羧基功能化磁性碳纳米管复合材料Fe3O4-Cys@CNT。与传统的磁性碳纳米管相比，Fe3O4-Cys@CNT具有制备方法简单、合成时间短、绿色环保及表面富含羧基官能团等优点。将Fe3O4-Cys@CNT 作为吸附剂，建立了猪肉样品中痕量CLB 及RAC的MSPE/超高效液相色谱（UPLC）分析方法，并将该方法应用于市售猪肉样品中CLB和RAC的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

配有TUV 紫外检测器的H-Class 超高效液相色谱仪（美国Waters 仪器公司）；EP115 型烘箱（德国Binder 仪器公司）；JEM-2100F 型透射电镜（TEM，日本电子株式会社JEOL）；D8 Advanced X-射线衍射仪（XRD，德国Bruker公司）。

盐酸克伦特罗（CLB，纯度99%）、莱克多巴胺（RAC，纯度99%）购于美国Sigma-Aldrich 公司；甲醇、乙腈（色谱纯）购于美国Fisher 公司；半胱氨酸（L-Cys）、CNT（分析纯）购于上海阿拉丁公司；其它试剂均为分析纯。

1.2 标准溶液配制

称取5.0 mg CLB、RAC 标准品，置于10 mL洁净的容量瓶内，加入5.0 mL 甲醇配制成质量浓度为1 000 mg/L的混合标准储备液，4 ℃下保存。移取100 μL混合标准储备液于10 mL洁净的容量瓶内，用甲醇定容至10 mL，得到10 mg/L的CLB、RAC混合工作液，4 ℃下保存备用。

1.3 色谱条件

色谱柱：BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美国Waters仪器公司）；检测波长：210 nm；流动相：乙腈∶1%甲酸水（80∶20）；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

1.4 磁性吸附剂制备

称取1.7 g FeSO4和0.7 gL-Cys 分别溶于30 mL 超纯水中。将上述两种溶液迅速混合，加入48 mL 1 mol/L 的NaOH，25 ℃超声5 min 后，在上述溶液中加入0.3 g CNT，在超声条件下继续反应20 min。反应结束后，用无水乙醇和超纯水反复洗涤产物至洁净，60 ℃真空干燥6 h，得到Fe3O4-Cys@CNT。

1.5 实际样品处理

猪肉样品购自吉林市当地超市。参考国家标准方法（GB/T 5009.192-2003）［14］提取猪肉样品中的CLB 及RAC。称取猪肉样品10 g 于烧杯中，加入20 mL 高氯酸溶液（0.1 mol/L）进行匀浆处理，沉淀蛋白。25 ℃超声处理20 min 后，在80 ℃水浴条件下加热10 min，取出冷却至室温，于10 000 r/min 离心10 min，上清液转移至50 mL 离心管中。将残渣用5 mL 高氯酸溶液（0.1 mol/L）重复提取，合并2 次提取液，用超纯水稀释至50 mL，并用氢氧化钠溶液（1 mol/L）将其pH调至7±0.1，4 ℃下保存备用。

1.6 磁性固相萃取过程

将20 mg Fe3O4-Cys@CNT 分散到10 mL 上述提取液中，涡旋振荡10 min，磁分离后弃去上清液。用3 mL醋酸甲醇（15∶85，体积比）对目标分析物进行涡旋洗脱，洗脱时间为10 min。收集洗脱液，氮气浓缩后用超纯水复溶至500 μL，进行UPLC 分析。在此实验过程中，对pH 值、萃取时间、吸附剂用量、洗脱时间、洗脱溶剂种类及体积等进行了优化并对吸附剂的重复使用性进行了评估。

2 结果与讨论

2.1 磁性吸附剂的制备

在超声条件下，采用温和的氧化-沉淀法合成Fe3O4-Cys@CNT。在碱性条件下，以Fe2+作为铁源，空气中的O2作为氧化剂，在保护剂L-Cys的作用下，O2将Fe2+氧化为Fe3O4。同时，L-Cys可通过—SH 官能团中的S原子与金属的络合作用被枝接在磁性材料表面，为磁性NPs提供氨基和羧基［15］。在超声作用下，Fe3O4-Cys NPs上的氨基和羧基进一步通过氢键与CNT结合，并均匀地分散在CNT表面。

2.2 磁性吸附剂的表征

图1A 为Fe3O4-Cys@CNT 的傅里叶变换-红外光谱（FT-IR）图。其中，在568 cm-1处的特征吸收为Fe3O4中Fe—O 键的拉伸振动；在3 438 cm-1处的吸收峰由L-Cys 分子和CNT 中O—H 的伸缩振动引起；在1 612 cm-1、1 178 cm-1和1 069 cm-1处的吸收峰分别由C==O、C—N和C—O的伸缩振动引起［16］，表明Fe3O4-Cys 成功地修饰于CNT 表面。Fe3O4NPs 赋予了吸附剂磁性，而L-Cys 分子中的氨基及羧基增强了吸附剂的亲水性。

图1 Fe3O4-Cys@CNT的FT-IR谱图（A）、XRD谱图（B）以及TEM图（C、D）Fig.1 FT-IR analysis（A），XRD patterns（B）and TEM images（C and D）of Fe3O4-Cys@CNT

Fe3O4-Cys@CNT 的XRD 谱图如图1B 所示。在2θ= 30.26°、35.42°、43.23°、53.91°、57.23°和62.82°处的特征衍射峰，分别对应立方反尖晶石结构Fe3O4的（220）、（311）、（400）、（422）、（511）和（440）晶面的特征衍射［17］，此外，在2θ= 26.3°处观察到CNT（002）晶面的特征衍射峰［18］。结果表明，Fe3O4NPs成功地连接在CNT表面，且未发生晶体结构的变化。

图1C 和图1D 为Fe3O4-Cys@CNT 的TEM 图。由图可见，Fe3O4-Cys 为单分散的球形结构，其粒径约为20 nm，CNT为细长管状，管内径约为5 nm，管壁厚约为5 nm，Fe3O4-Cys NPs均匀地分布在CNT表面。

2.3 固相萃取条件的优化

2.3.1 萃取条件的优化考察了溶液pH 值（pH 3～11）对目标分析物萃取效率的影响。如图2A 所示，在pH 值为5、7、9 时2 种目标物的回收率较好且在pH 9 时达到最佳。CLB 的酸度系数（pKa）值为9.9，RAC 的酸度系数pKa1值为8.9、pKa2值为10.3［19］，经测定Fe3O4-Cys@CNT 的零点电位（pHpzc）为6.5。因此，在强酸性介质中，磁性吸附剂与目标分析物之间的静电斥力增强，使得萃取效率大大降低。随着pH值的增大，吸附剂与目标物之间的静电斥力逐渐降低，CLB及RAC与CNT之间的氢键作用及π-π作用［20］使得Fe3O4-Cys@CNT在较宽的pH值范围内对二者均具有较高的萃取效率。在强碱性（pH 11）介质中，Fe3O4-Cys@CNT表面的负电荷与带负电的分析物之间静电斥力增强，使得吸附剂对分析物的萃取效率下降。因此，选择最佳pH值为9。

图2 溶液pH（A）、吸附剂用量（B）、洗脱溶剂种类（C）和洗脱时间（D）对目标物回收率的影响Fig.2 Effects of pH value（A），adsorbent mass（B），eluent type（C）and elution time（D）on the recoveries of analytes C：1.methanol；2.acetonitrile；3.acetic acid/methanol（15∶85）；4.acetic acid/acetonitrile（15∶85）；5.ammonia/methanol（10∶90）

进一步考察了吸附剂Fe3O4-Cys@CNT 质量（5～30 mg）对CLB 及RAC 萃取效率的影响。由图2B 可看出，随着吸附剂质量从5 mg增至10 mg，萃取效率快速增加，当吸附剂质量增至15 mg时萃取效率达到平衡。因此，选择吸附剂Fe3O4-Cys@CNT的最佳用量为15 mg。此外，在5～30 min范围内对萃取时间进行了优化。由于吸附剂具有足够的吸附位点，CLB及RAC在前5 min能够被快速萃取，并在10 min时达到吸附平衡。因此，选择最佳萃取时间为10 min。

2.3.2 洗脱条件的优化考察了甲醇、醋酸/甲醇（15∶85，体积比，下同）、氨水/甲醇（10∶90）、乙腈、醋酸/乙腈（15∶85）5 种溶剂对目标分析物萃取效率的影响。如图2C 所示，以醋酸/甲醇（15∶85）和醋酸/乙腈（15∶85）作为洗脱溶剂时目标物的萃取效率高于甲醇和乙腈，由于乙腈毒性较大，因此选择醋酸/甲醇（15∶85）作为洗脱溶剂。此外，酸性/碱性甲醇的洗脱效果均优于甲醇。一方面，在甲醇中加入酸/碱溶液，破坏了分析物与吸附剂间的氢键作用，使分析物与洗脱溶剂的亲和力增强［21］。另一方面，CLB 及RAC 均为极性化合物，在甲醇中添加酸/碱溶液提高了洗脱溶剂的极性，从而能够更好地将目标分析物从吸附剂表面洗脱［22］。进一步考察了洗脱时间在2～20 min 范围内对萃取效率的影响。如图2D 所示，当洗脱时间为10 min 时，2 种目标物的萃取效率达到最优且不再增加（RAC 和CLB 的萃取效率分别为85.87%、83.06%），因此选择洗脱时间为10 min。同时考察了洗脱溶剂体积（0.5～4 mL）对萃取结果的影响，当洗脱溶剂体积为3 mL 时，Fe3O4-Cys@CNT 对CLB 及RAC的萃取效率最佳。

2.4 吸附剂的重复使用性

为考察Fe3O4-Cys@CNT 的稳定性和重复使用性，将吸附剂连续用于提取液中CLB 及RAC 的萃取。结果表明Fe3O4-Cys@CNT 复合材料性质稳定，重复4个循环后，萃取效率降低不超过3%，重复5个循环后，萃取效率降低13.6%，说明Fe3O4-Cys@CNT能够重复使用4次。

2.5 方法评价

2.5.1 线性关系、检出限及定量下限在10 mL 空白猪肉提取液中添加不同质量浓度的CLB 及RAC标准溶液，在最佳MSPE条件下进行样品前处理及UPLC检测。以目标物的峰面积（Y）与其质量浓度（X，μg/L）进行线性回归，绘制标准工作曲线。并分别以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）计算得到该方法的检出限（LOD）和定量下限（LOQ）。结果表明，CLB 和RAC均在0.5～100 μg/L范围内线性关系良好（r≥0.997 4），LOD和LOQ分别为0.15 μg/L和0.50 μg/L。

2.5.2 准确度与精密度在10 mL 空白猪肉样品提取液中添加CLB 及RAC 标准溶液，配制3 个浓度水平（1、10、100 μg/L）的加标样品溶液，在优化条件下进行样品前处理及检测（每个水平平行测定3 次）。结果表明，在3 个加标水平下，CLB 的回收率分别为112%、100%和95.1%，RAC 的回收率分别为96.6%、104%和98.7%，相对标准偏差（RSD）均小于11%。说明该方法具有良好的准确度和精密度。

2.5.3 与其他方法的对比表1为所建立的MSPE/UPLC方法与检测CLB及RAC的文献方法的比较结果。与文献方法相比，本方法的线性范围更宽，检出限比多数文献方法更低。此外，Fe3O4-Cys@CNT合成时间仅需25 min，经充分干燥后即可使用，且具有制备方式绿色、简便、成本低廉等优势。由于具有磁性，Fe3O4-Cys@CNT能够通过磁分离的方式从溶液中快速、方便地分离，从而提高了样品前处理的效率。

表1 建立的MSPE方法与其他用于测定不同样品中CLB及RAC方法的比较Table 1 Comparison of the developed MSPE method with other methods for the determination of CLB and RAC in different samples

2.6 实际样品测定

从当地市场随机抽取5 份（1 号、2 号、3 号、4 号、5 号）猪肉样品，采用本方法测定其中CLB 及RAC 的含量。其中3 号和5 号样品中检出CLB，质量浓度分别为0.76 μg/L 和1.5 μg/L，均低于国家标准（GB/T 5009.192-2003）规定的最高允许添加量［14］。图3A 为5 号阳性猪肉样品的色谱图，图3B 为1号猪肉空白样品、加标及加标萃取后的色谱图。由图可见，经MSPE处理后，目标物的峰形良好，峰信号显著增强，杂峰减少，表明有效去除了基质干扰。

图3 5号阳性猪肉样品（A）与1号猪肉样品（B）的色谱图Fig.3 Chromatograms of a No.5 positive pork sample（A）and a No.1 pork sample（B）

3 结 论

本研究在超声辅助条件下，使用低成本、环保的化学试剂，通过简便的氧化-沉淀法制备了羧基功能化磁性碳纳米管复合材料Fe3O4-Cys@CNT。该材料兼具Fe3O4及CNT 的优势，L-Cys 的成功修饰使吸附剂表面具有丰富的活性基团，这些特点使得Fe3O4-Cys@CNT 易于固液分离，具有萃取时间短（萃取和洗脱时间共20 min）、萃取效率较高（RAC 和CLB 的萃取效率分别为85.87%、83.06%）等优势。以Fe3O4-Cys@CNT 作为吸附剂，建立了同时检测猪肉样品中痕量CLB 及RAC 的MSPE/UPLC 方法。该方法对CLB及RAC的LOD均为0.15 μg/L，回收率为95.1%～112%，RSD小于11%，为复杂食品和生物样品中瘦肉精的检测提供了新思路。