基于数据挖掘和网络药理学的左右半结肠癌中医组方用药规律差异及作用机制研究*

庄振杰，谢静怡，朱 泳，罗丽霞，刘展华

（1.广州中医药大学第一临床医学院 广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院 广州 510405）

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，严重危害人类健康。流行病学数据显示，全球结直肠癌年发病率和死亡率分别位居所有癌种的第四位和第二位，疾病负担日趋沉重[1]。由于左右半结肠癌具有不同的生物学特性，两者在临床表现、分子生物学特征等多方面具有较大差异，因此学界有观点认为左、右半结肠癌应被视作两种不同类型的实质疾病[2]。临床上，左半结肠癌的病理类型以高度及中度分化的腺癌为主，预后相对较好；右半结肠癌病理类型多见低分化的腺癌、粘液腺癌和印戒细胞癌，预后较差。基于AIO KRK-010[3]、NCIC CO.17[4]及FIRE-3[5]等临床研究结果，自2017年起，美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南将抗EGFR治疗（西妥昔单抗和帕尼单抗）仅推荐用于KRAS/NRAS野生型的左半结肠癌，标志着左右半肠癌临床用药决策上进入了新阶段。然而，中医学对左右半结肠癌辨证施治的组方用药规律尚鲜有报道，有待进一步研究。

近年来研究表明，左右半结肠癌的中医证型特点和症候要素具有一定的差异。王威[6]对151例结肠癌患者的中医证型特点分析表明，左半结肠癌以痰湿内停证为主，晚期右半结肠癌以脾肾阳虚证为主。吴桂彬[7]研究指出，左半结肠癌多见气滞血瘀证及湿热蕴结证，而右半结肠癌多见脾肾阳虚证及气血两虚证。

辨证论治是中医的精髓，“方从法出，法随证立”，不同的证型和症候特点决定了左右半结肠癌在方药使用上必然存在一定的差异。因此，左右半结肠癌的中医组方用药的差异及内涵值得进一步探究。同时，由于中药治疗疾病具有“多成分-多靶点”的作用特点，中医药治疗结肠癌的作用机制也仍有待进一步的研究。值得庆幸的是，真实世界中临床的诊疗数据积累及数据挖掘技术在中医药领域的应用[8]及网络药理学技术的兴起[9]，为透过大数据探寻中医药防治左、右半结肠癌的方药规律及相关作用机制奠定了基础。

本研究旨在基于“左右半结肠癌是两种不同实质性疾病”的学术观点，应用广州中医药大学第一附属医院住院系统数据，挖掘分析左右半结肠癌组方用药规律，同时借助生物信息学及网络药理学技术对典型的方药进行作用机制的探索，为中医药对结肠癌实施精准治疗及防治结肠癌的基础研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源

2017.1.1-2020.6.30于广州中医药大学第一附属医院肿瘤中心、胃肠外科及肛肠外科住院部被确诊为结肠恶性肿瘤患者的中医临床诊疗信息。纳入本研究的中药处方数据均由肿瘤专科主任中医师开具。数据收集经广州中医药大学第一附属医院伦理委员会批准，伦理文件编号：NO.JY【2020】129。

1.2 标准

1.2.1 纳入标准

①确诊为结肠恶性肿瘤患者；右侧结肠标准：右侧结肠包括盲肠、升结肠、结肠肝区、横结肠；左侧结肠包括结肠脾区、降结肠、乙状结肠；②患者病历资料完善者：具备患者的基本信息、中医诊断、西医诊断、中医方药信息、肿瘤分期（TMN及临床分期）、肿瘤发生部位、肿瘤病理及转移部位。

1.2.2 排除标准

符合以下条件之一者则排除研究对象：①不符合原发性结肠癌诊断标准的患者；②所需观察的临床病历信息记载不完整；③合并有严重心脑血管、肝、肾疾病及内分泌系统疾病的患者；④确诊但是为结肠外双原发（及以上）肿瘤患者；⑤确诊但于外院接受过放化疗、靶向及免疫治疗的患者。

1.3 统计方法与数据分析

1.3.1 临床数据数据库构建

筛选后共录入383首处方，由两名研究者对住院病历系统进行录入，并参照《中华人民共和国药典》（2015版）进行药物规范化处理（如熟党参统计为党参；人参片统一为人参）。另一研究者对数据进行核查校对。

1.3.2 中药频次计算

将方药数据库中所有药物进行汇总，计算各药物出现的频次，筛选出频次前15的药物进行展示。应用R软件4.0 base包的table函数进行频次计算。

1.3.3 方药聚类分析

通过对左、右半结肠癌方药数据进行整理清洗，分别筛选使用频次大于整体中药平均频次的药物，使用R软件包apcluster[10]评估最佳聚类数，使用R软件包cluster[11]进行K-means聚类分析，迭代10 000次以确定最佳聚类种子数。最后使用R软件包factoextra①* Kassambara A, Mundt F（2020). _factoextra: Extract and Visualize the Results of Multivariate Data Analyses_. R package version 1.0.7 （未出版）*进行聚类结果可视化。

1.3.4 药物关联性分析

应用R语言arules包[12]进行关联规则分析。基于arules包interestMeasure函数对关联规则结果行卡方检验，同时结合Apriori关联规则算法中如下指标对中药组合关联度进行综合评价，并使用Cytoscape 3.7.2[13]进行关联规则网络可视化。

①支持度（support）：

支持度即支持的程度，在本研究中，指在所有的药物中同时出现中药X和中药Y的概率，即P(XY)。支持度揭示了药物X和药物Y同时出现的频率，如果X和Y一起出现的频率非常小，则表明了X和Y之间的关联并不大；反之则说明X和Y总是相关联性强。

②置信度（confidence）：

置信度也称为可靠度，在本研究中，置信度表示药物之间关联的可信度，指在所有中药中在中药X出现的情况下中药Y出现的概率，即P(Y|X)。

③提升度（lift）：

在本研究中，提升度表示关联规则在出现中药X的条件下，同时出现中药Y的概率，提升度体现的是中药X和Y之间的关联关系强度, 提升度大于1则表明X→Y是有效的强关联规则，提升度小于等于1则表明X→Y是无效的强关联规则。

本研究筛选同时满足以下标准的方药关联规则作为左右半结肠癌方药矩阵的核心关联规则：①关联规则经卡方检验，所得P〈 0.01；②关联规则支持度 〉 矩阵平均支持度；③关联规则置信度 〉 矩阵平均置信度；④关联规则提升度 〉 1。

1.4 网络药理学分析

1.4.1 研究对象

通过药物关联规则算法分析得到治疗左、右半结肠癌的关联参数均值最优的代表性方药，将左右半结肠癌代表性方药进行比对，选取各自的代表性“角药”组合作为研究对象。左半结肠癌方药研究对象为“半枝莲-法半夏-陈皮”，右半结肠癌方药研究对象为“地榆-生甘草-槐花”。

1.4.2 左、右半结肠癌疾病相关基因靶点获取

在GeneCards数据库①* https://www.genecards.org/*[14]中以“Colon Cancer”为检索关键词，获取结肠癌疾病相关靶点。使用R软件包TCGAbiolinks[15]下载癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库②** https://www.tcga.org/**中的结肠癌的转录组数据及临床信息数据，以结肠癌原发部分的左右作为主要分层因素。使用R软件包DESeq2[16]对左、右半结肠癌转录组数据同癌旁正常组织转录组数据行差异表达分析，以分别筛选左、右半结肠癌的差异基因。筛选阈值设定为P-adjust＜0.05&|log2FC|≥1。

1.4.3 典型方药药物成分及基因靶点信息获取

从Batman-TCM[17]数据库③*** http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php***中收集左、右半结肠癌典型方药成分的化合物和靶基因。以数据库官方提供的默认阈值作为筛选标准，筛选药物成分及其靶点数据。

1.4.4 药物-成分-疾病核心基因靶点网络构建

将左、右半结肠癌典型方药的药物靶点分别同左、右半结肠癌疾病靶点基因进行匹配映射，使用Cytoscape 3.7.2[13]构建药物-成分-疾病核心基因靶点网络。使用Degree（连接度）筛选典型方药治疗结肠癌的关键成分和靶点。

1.4.5 典型方药治疗结肠癌基因靶点蛋白互作网络构建

将典型方药的治疗左、右半结肠癌的靶点基因分别输入STRING 11.0数据库中④**** https://string-db.org/****构建蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interactions，PPI）网络。

1.4.6 典型方药治疗结肠癌核心基因靶点的生物信息学注释

使用R软件包ClusterProfiler[18]对典型方药治疗结肠癌靶点基因进行基因本体分析（Gene Ontology，GO）及KEGG通路分析。将设置注释物种设置为“hsa”（人类），将P值阈值设置为0.01，仅纳入P.adjust值≤0.01的结果，并对结果按富集基因总数从大到小进行排序，并对排序前5的GO条目及排序前10的KEGG通路进行可视化。

2 结果

2.1 左、右半结肠癌中药药味分析

2.1.1 左、右半结肠癌典型药味分析

左右半结肠癌方药数据药物共270味。其中，左半结肠癌使用的中药味数为220味，中药的总频数为2932，药物平均频数为13.33次，使用频数大于平均频数的药物为48味；右半结肠癌使用中药共226味，药物总频数为2404，药物平均频次为10.64次，使用频数大于平均频数的药物为57味。本研究将使用频次大于所在分组平均频次的药物，作为左、右结肠癌治疗应用的典型药味。进一步分析表明（图1），左、右半结肠癌典型药味中共有44味药物为共同使用药物。

图1 左右半结肠癌典型药味韦恩图

卡方检验分析结果表明，左、右半结肠癌方药在桃仁（36.2% VS 25.3%）、柴胡（17.4% VS 32.4%）、地榆（29.1% VS 14.7%）、龙葵（18.3% VS 10%）4味典型药物的使用上具有显著统计学差异（P〈 0.05）。见表1。

表1 左、右半结肠癌使用具有统计学差异的共同典型药物

左半结肠癌独有的典型药物包括预知子、壁虎、葛根及鸡血藤4味，右半结肠癌独有的典型药物包括泽泻、黄芩、女贞子及延胡索等12味。见表2。

表2 左、右半结肠癌独有典型药物

2.2 左、右半结肠癌药物聚类分析

2.2.1 左半结肠癌药物聚类分析结果

左半结肠癌方药矩阵R软件包apcluster[10]推荐最佳聚类数为18，聚类结果见表3，聚类分布见图2(a)。

表3 左半结肠癌方药核心组合

2.2.2 右半结肠癌药物聚类分析结果

右半结肠癌方药矩阵，R软件包apcluster[10]推荐最佳聚类数亦为18。聚类结果见表4，聚类分布见图2(b)。

图2 左右半结肠癌方药聚类分布

表4 右半结肠癌方药核心组合

2.3 左、右半结肠癌药物关联分析

2.3.1 左、右半结肠癌方药关联规则结果概况

基于Apriori关联规则算法计算获得左半结肠癌关联规则共2320条，右半结肠癌关联规则共1015条。经筛选，最终获得左半结肠癌核心关联规则22条，右半结肠癌关联规则37条。

2.3.2 左半结肠癌方药关联规则

符合筛选标准的左半结肠癌方药关联规则共22条，其中药对规则2条，角药规则6条，其余组方规则14条（药味为四规则9条，药味为五规则4条，药味为六规则1条）。其中，支持度、置信度及提升度3项参数均值最高的药对及角药规则分别为{山慈菇} =〉 {白术}（参数均值：0.82）及{半枝莲,法半夏} =〉 {陈皮}（参数均值：0.94）。见表5。

表5 左半结肠癌方药核心关联规则

2.3.3 右半结肠癌方药关联规则

符合筛选标准的右半结肠癌方药关联规则共37条，其中药对规则5条，角药规则23条，其余组方规则9条（药味为四规则8条，药味为五规则1条）。其中，支持度、置信度及提升度3项参数均值最高的药对及角药规则分别为{茯苓} =〉 {白术}（参数均值：0.83）及{地榆,生甘草} =〉 {槐花}（参数均值：1.25）。见表6。

表6 右半结肠癌方核心关联规则

3 核心配伍机制探讨

3.1 左、右半结肠癌潜在药物作用靶点获取

3.1.1 左、右半结肠癌差异基因鉴定

本研究从TCGA数据库共获得521个结肠癌样本数据（肿瘤样本480个，癌旁样本41个）。其中根据临床信息划分左右半结肠癌的肿瘤样本共计451个（左半结肠癌样本186个，右半结肠癌样本265个）。分别将左、右半结肠癌样本与癌旁组织进行差异分析以鉴定差异基因，最终获得左半结肠癌差异基因5636个，右半结肠癌差异基因5294个，两者共同差异基因4670个。左半结肠癌独有差异基因966个，右半结肠癌独有差异基因624个，这些独有的差异基因是介导左、右半结肠癌不同生物学特征的重要生物学基础。见图3。

图3 左、右半结肠癌差异基因鉴定

3.1.2 左、右半结肠癌疾病相关基因靶点鉴定

以“Colon Cancer”为关键词从Genecards数据库下载获得结肠癌相关疾病基因共4916个。将其分别3.1.1中分析得到的左、右半结肠癌独有的差异基因分别进行取交集，最终得到左半结肠癌疾病相关基因共234个；右半结肠癌疾病相关基因共143个。这些差异基因可作为左、右半结肠癌典型方药治疗结肠癌的潜在药物靶点。见图4。

图4 左、右半结肠癌疾病相关基因韦恩图

3.2 左半结肠癌典型方药治疗左半结肠癌的网络药理学分析

3.2.1 左半结肠癌典型方药成分及作用靶点数目

从BATMAN-TCM数据库分别获取中药半枝莲、半夏、陈皮的药物成分及作用靶点数据。共获得半枝莲药物成分3个，靶点39个；半夏药物成分25个，靶点1111个；陈皮成分332个，靶点603个。去重后共获得药物成分60个，靶点1328个。

3.2.2 左半结肠癌典型方药治疗左半结肠癌的靶点鉴定

通过构建左半结肠癌典型方药-成分-疾病-靶点网络，最终共鉴定得左半结肠癌典型方药治疗左半结肠癌涉及半枝莲主要成分1个，作用于2个疾病靶点；半夏主要成分17个，作用于28个疾病靶点；陈皮主要成分24个，作用于15个疾病靶点。所有药物主要成分去重后共计42个，药物-疾病靶点去重后共计33个。

左半结肠癌典型方药-成分-疾病-靶点网络分析表明，网络中共有79个节点，194条相互作用关系。见图5。Degree排序靠前的药物成分为麻黄素（Ephedrine），γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid），葫芦巴碱（Trigonelline）等，这些成分在网络中具有重要作用，可作为左半结肠癌典型方药抗癌治疗的关键成分。见表7。

图5 左半结肠癌典型方药-成分-疾病-靶点网络

表7 左半结肠癌典型方药关键药物成分信息

3.2.3 左半结肠癌典型方药治疗左半结肠癌的靶点PPI网络分析

将左半结肠癌典型方药“半枝莲-法半夏-陈皮”治疗左半结肠癌的靶点输入STRING数据库，构建靶点PPI网络。见图6。Degree排序靠前的靶点为ESR1，KITLG及FASLG等，表明这些基因在网络中具有重要地位，为“半枝莲-法半夏-陈皮”有效成分作用的核心靶点基因。见表8。

图6 左半结肠癌典型方药抗癌治疗靶点PPI网络

表8 左半结肠癌典型方药治疗左半结肠癌核心靶点

3.2.4 左半结肠癌典型方药治疗左半结肠癌的靶点生物信息学注释

通过对“半枝莲-法半夏-陈皮”治疗左半结肠癌靶点进行GO和KEGG注释。共计获得GO条目条，含生物学过程（biological process，BP）141条，细胞组分（cellular component，CC）9条，分子功能（Molecular function，MF）10条，获得KEGG通路条目124条。结果表明，“半枝莲-法半夏-陈皮”治疗左半结肠癌主要涉及的生物学过程（BP），主要包括氧水平反应、肽链内切酶活性调节及凋亡信号通路调控；涉及的细胞组分（CC）主要包括囊腔、膜区域及膜筏。涉及的分子功能（MF）主要包括细胞因子受体结合、细胞因子活性及转录辅因子结合。见图7。

图7 左半结肠癌典型方药治疗左半结肠癌靶点GO富集条形图

KEGG富集结果表明，“半枝莲-法半夏-陈皮”治疗左半结肠癌靶点主要富集于MAPK信号通路、RAS信号通路及PI3K-AKT信号通路。见图8。

图8 左半结肠癌典型方药治疗左半结肠癌靶点KEGG富集高级气泡图

3.3 右半结肠癌典型方药治疗右半结肠癌的网络药理学分析

3.3.1 右半结肠癌典型方药成分及作用靶点数目

从BATMAN-TCM数据库分别获取中药地榆、生甘草、槐花的药物成分及作用靶点数据。共获得符合筛选标准的其中地榆药物成分14个，靶点496个；生甘草药物成分75个，靶点691个；槐花成分4个，靶点366个。去重后共获得药物成分92个，靶点1022个。

3.3.2 右半结肠癌典型方药治疗右半结肠癌的靶点鉴定

通过构建右半结肠癌典型方药-成分-疾病-靶点网络，最终共鉴定得到右半结肠癌典型方药治疗右半结肠癌涉及地榆主要成分6个，作用于8个疾病靶点；甘草主要成分16个，作用于9个疾病靶点；槐花主要成分2个，作用于7个疾病靶点。所有药物主要成分去重后共计23个，药物-疾病靶点去重后共计15个。

右半结肠癌典型方药-成分-疾病-靶点网络分析表明，网络中共有42个节点，78条相互作用关系（图9）。Degree排序靠前的药物成分为白桦脂醇（Betulin）及熊果酸（Ursolicacid）等，这些成分在网络中具有重要作用，可作为右半结肠癌典型方药抗癌治疗的关键成分。见表9。

图9 右半结肠癌典型方药-成分-疾病-靶点网络

表9 右半结肠癌典型方药关键药物成分信息

3.3.3 右半结肠癌典型方药治疗右半结肠癌的靶点PPI网络分析

右半结肠癌典型方药“地榆-生甘草-槐花”治疗右半结肠癌的靶点PPI网络（见图10）中共有15节点和11条相互作用关系。网络中介性（Betweenness）平均值为0.17，紧密度（Closeness）为0.44，Degree平均值为2.2。Degree排序靠前的靶点为MAPK3，IFNG及PTGS2等，表明这些基因在网络中具有重要地位，为“地榆-生甘草-槐花”有效成分作用的核心靶点基因。见表10。

图10 右半结肠癌典型方药抗癌治疗靶点PPI网络

表10 右半结肠癌典型方药治疗右半结肠癌核心靶点

3.3.4 右半结肠癌典型方药治疗右半结肠癌的靶点生物信息注释

通过对“地榆-生甘草-槐花”治疗右半结肠癌靶点进行GO和KEGG注释。共计获得GO条目条（见图11），含BP 316条，CC 23条，MF 30条，获得KEGG通路条目154条。结果表明“地榆-生甘草-槐花”治疗右半结肠癌靶点涉及的生物学过程（BP）主要包括类固醇代谢过程、防御反应的正向调控及炎症反应的正向调控；涉及的细胞组分主要包括核膜、膜区域及膜筏：涉及的分子功能主要包括：四吡咯结合、血红素结合及离子通道活性。

图11 右半结肠癌典型方药治疗右半结肠癌靶点GO富集条形图

KEGG富集分析结果显示（见图12），“地榆-生甘草-槐花”治疗右半结肠癌靶点主要富集于IL-17信号通路、VEGF信号通路及TNF信号通路。

图12 右半结肠癌典型方药治疗右半结肠癌靶点KEGG富集高级气泡图

4 讨论

“整体观念”与“辨证论治”是中医学的两大基本特点，在治疗肿瘤疾病过程中，当重视辨病与辨证相结合，其中辨病是对疾病发生、发展全过程有一个纵向的认识，而辨证是对疾病发生、发展过程中某一阶段各方面生理特性的横断面的认识。一病有数证，同一疾病随发展阶段或发病部位的不同，其证型亦会有所不同，当采取不同的治法，即“同病异治”。基于“整体观念”而言，结肠癌作为一个整体决定了疾病的基本属性，而左右半结肠癌不同的疾病特点又构成了结肠癌疾病本身“矛盾”的一体两面。

网络药理学是一种整体特性的研究方法，旨在从系统、网络的角度对中医药多靶点整合调节的作用机制[19-20]，其研究的逻辑及思路与中医整体观念不谋而合。网络药理学为研究者基于“整体观”研究中医药作用机制提供了强有力研究策略支持。

深入研究中医药治疗左右半结肠癌的药味的施用特点及规律有助于增进中医学对结肠癌病机及证型特点的认识水平，同时裨益于中医临床诊疗。

4.1 左、右半结肠癌常用药物及核心组合存在差异

“同病异治”的观念体现在药味及药物组合使用差异中，这与左、右半结肠癌不同病机特点及常见证型息息相关。在共同使用的44味典型药味中，左半结肠癌桃仁、地榆及龙葵使用频率高于右半结肠癌，而右半结肠癌柴胡使用比例高于左半结肠癌。桃仁功擅活血化瘀，龙葵可清热解毒及地榆凉血止血，俱为治疗左半结肠癌瘀毒内结证之良药；柴胡可疏肝行气、升举阳气，则可用于右半结肠癌突出之脾肾阳虚及肝肾阴虚证。在差异使用的典型药味方面，左半结肠癌预知子、壁虎等4味药能活血解毒散结、生津养血，右半结肠癌泽泻等14味药则可利湿行气、补益肝肾。药物施用差异与左半结肠癌多见气滞血瘀、湿热内结及右半结肠癌证型多见肝肾阴虚的证型特点分布存在基本相符[7]。

另一方面，本研究表明左、右半结肠癌临床上施用的药物核心组合存在一定的差异。左半结肠癌药物核心组合整体上突出清热解毒、行气活血的功效特点。核心组合如“浙贝母-猫爪草-桔梗”中，浙贝母清热化痰散结，猫爪草解毒化痰散结、桔梗宣肺排脓又兼有引经之用，三药均归肺经，其治之药与中医“肺与大肠表里”理论相符。该组合可作为左半结肠癌痰湿结聚、兼夹毒邪的选用方药。又如核心组合“南方红豆杉-广藿香-麦芽-枳实-稻芽-陈皮”，药理学研究表明南方红豆杉含有紫衫烷化合物[21]，且该药也是临床常用抗癌中药。陈皮、广藿香两药相合可健脾化湿，枳实行气消痞，麦芽、谷芽健脾和胃。诸药合用，攻补兼施舍，既可攻癌消痞，又能健脾益气，攻邪而避免伤正。

右半结肠癌的药物核心组合整体功效则彰显健脾益气、养血补血的特点。核心组合如“当归-黄芪”，当归可活血养血，黄芪可健脾益气，托毒排脓。核心组合如“香附-川芎-败酱草-延胡索-牡丹皮-乌药”，香附、川芎、延胡索、乌药相配可疏肝行气活血止痛，丹皮可活血化瘀，败酱草可消痈排脓。诸药合用，以调血理气为主，又兼有排脓之功，与“行血则便脓自愈，调气则后重自除”的理论相合，可用于气滞血瘀之证较明显的结肠癌患者。

关联规则分析可用于挖掘分析方药中的常用药物配伍规律。本研究中左、右半结肠癌在关联规则上存在一定的差异，左半结肠癌代表性核心关联规则分别为“山慈菇-白术”、“半枝莲-法半夏-陈皮”等。山慈菇功能清热解毒，消痈散结，配合白术甘温补气健脾，两药配伍正切合左半结肠癌脾虚又多夹癌毒的特点；半枝莲功能清热解毒，散瘀止血，半夏辛温功能燥湿化痰、消痞散结，再配合陈皮健脾理气，三药相合可舒调中焦气机，力散结聚之痰。右半结肠癌关联规则代表性核心关联规则分别为“茯苓-白术”、“地榆-生甘草-槐花”等。茯苓、白术两药配伍可健脾益气，利水渗湿，为治疗脾虚证的常用药对，在经典方剂如四君子汤、参苓白术散及二陈汤等中均有运用；地榆功能凉血止血，解毒敛疮，槐花凉血止血兼清肝泻火，再配伍甘草一者可清热解毒，二者兼有甘缓调药之用，可以防止诸药寒凉太过损耗阳气。

4.2 治疗左、右半结肠癌潜在分子机制不同点分析

4.2.1 不同的有效成分

网络药理学分析结果显示，左半结肠癌典型方药“半枝莲-法半夏-陈皮”的关键抗癌成分包括γ-氨基丁酸、葫芦巴碱等，这些成分为该典型方药规则的重要药效基础。既往研究表明，这些关键成分均具有一定的直接抗癌作用。An等[22]研究结果显示，产γ-氨基丁酸的乳杆菌可通过介导γ-氨基丁酸受体通路抑制对5-FU耐药的HT-29结肠癌细胞的转移性并诱导肿瘤细胞凋亡，产γ-氨基丁酸的乳杆菌有望成为对5-FU耐药的结肠癌患者的辅助用药。本研究中γ-氨基丁酸的所属药物为半夏，笔者推测该药物含有的γ-氨基丁酸成分或可通过类似的机制调节结肠癌患者对5-FU的耐药从而体现中医药协同化学治疗的“增效”作用。Tazehkand等[23]研究显示葫芦巴碱可通过抑制红细胞核因2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）的表达而减低SW480及LS174T结肠癌细胞系对奥沙利铂的耐药。

PPI网络分析显示，左半结肠癌典型方药核心抗癌治疗靶点为ESR1、FASLG及KITLG等。作为雌激素的主要受体之一，ESR1可通过调节凋亡蛋白以及细胞周期蛋白D1的表达促进细胞周期的转换和增殖信号的转导[24]。Fan等[25]研究表明ESR-1抑制剂可通过抑制ESR1表达，抑制NLRP3炎症小体活性，降低促炎细胞因子表达，抑制HCT116结肠癌细胞的增殖同时促进其凋亡；FASLG是肿瘤坏死因子（TNF）家族的一员，其主要功能是通过与受体FAS结合而活化T淋巴细胞进而诱导细胞凋亡[26]。FASLG与FAS在结肠癌细胞中存在共表达的情况，但结肠癌来源的细胞系通常对Fas介导的凋亡具有抗性[27]。实验研究表明，KITLG同样在结肠癌细胞系中存在异常表达，KITLG自分泌和/或旁分泌信号途径的激活与结肠癌细胞的生长增殖关系密切，敲除KITLG可使DLD1结肠癌细胞形成的异种移植瘤明显缩小[28]。

GO富集分析显示，“半枝莲-法半夏-陈皮”防治左半结肠癌的靶点涉及的生物学过程氧水平反应、肽链内切酶活性调节及凋亡信号通路调控。其中，尤以凋亡信号通路的调控值得引起重视。KEGG结果表明“半枝莲-法半夏-陈皮”防治左半结肠癌的靶点主要富集于MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路及RAS信号通路，文献报道显示，这三条通路在结肠癌的发生发展过程中均具有重要作用[29-30]。如研究表明，PI3K-AKT信号通路在包括结肠癌在内的多种恶性肿瘤中均存在异常激活。与正常细胞相比，肿瘤细胞的存活及抗凋亡多呈现PI3K/AKT依赖性，短期抑制PI3K/AKT信号诱导肿瘤细胞可能仅对正常细胞产生较小的毒性[31]。在本研究中，左半结肠癌典型方药核心作用靶点FASLG即富集于PI3K-AKT通路上。既往研究表明，PI3K/AKT抑制剂可增强 FASLG诱导HCT-15及 DLD-1结肠癌细胞系凋亡的作用。在较高浓度下，PI3K/AKT抑制剂诱导结肠癌细胞凋亡的同时还可显著促进FAS介导的凋亡信号转导[32]。

另一方面，右半结肠癌典型方药“地榆-生甘草-槐花”的关键抗癌成分主要包括白桦脂醇、熊果酸等。药理学研究表明，槐花关键成分白桦脂醇能抑制RKO和SW480结肠癌细胞的生长同时诱导细胞凋亡，并能抑制裸鼠移植瘤的生长，其机制与白桦脂醇结肠癌细胞中降低Sp1、Sp3和Sp4转录因子的表达水平有关[33]。此外，白桦脂醇还可通过抑制硬脂酰辅酶a脱饱和酶1（SCD-1）从而杀伤结肠癌干细胞[34]。既往研究表明熊果酸可通过下调Bcl-2和Bcl-xL的表达，活化Caspase-3和Caspase-9而间接诱导HT-29结肠癌细胞凋亡，并且熊果酸对HT-29细胞的生长抑制作用具有剂量和时间依赖性[35]。另一方面，研究表明熊果酸可通过抑制VEGF的表达及HIF-1α的积累，进而抑制肿瘤血管生成，同时在低氧条件下对结肠癌SW480细胞具有化疗增敏作用[36]。值得注意的是，本研究中，“地榆-生甘草-槐花”的核心靶点所富集的通路即包含VEGF信号通路，该通路与结肠癌血管生成密切相关[37]，因此抑制结肠癌血管生成可能是“地榆-生甘草-槐花”发挥抗癌作用的重要机制之一。

基于上述研究表明，γ-氨基丁酸、葫芦巴碱等成分可能是治疗左半结肠癌的药效物质基础，而白桦脂醇、熊果酸等可能是治疗右半肠癌的药效物质基础。

4.2.2 不同的靶点和通路

PPI网络分析显示右半结肠癌典型方药作用的核心靶点主要包括IFNG、MAPK3、PTGS2等。IFNG蛋白具有抗病毒活性和免疫调节功能，肿瘤浸润淋巴细胞中 IFNG 基因的高甲基化是肿瘤诱发免疫抑制的重要机制之一[38]。研究表明IFNG的两种标签单核苷酸多态性干扰素调节因子1及干扰素调节因子3与结肠癌发病风险增高有关[39]；MAPK3作为MAP激酶家族的一员，参与了细胞增殖、分化和细胞周期进程的调控，并与癌症的发生发展关系密切[40]。队列研究表明，MAPK3与结直肠癌KRAS基因突变显著相关（OR:1.34，95% CI:1.02-1.76），并且MAPK3的表达也与结直肠癌患者的不良预后有关[41-42]。PTGS2是前列腺素生物合成的关键酶，既是双加氧酶又是过氧化物酶。研究显示，在BRAF突变的结直肠中，肿瘤PTGS2的高表达与患者较差的远期生存相关（HR:2.4，95% CI:1.39-4.28），而在BRAF野生型的患者中PTGS2的表达水平则与患者的生存预后无关[43]。考虑到BRAF突变常见于晚期的右半结肠癌[44]，笔者推测右半结肠癌典型方药靶点或可通过靶向调控PTGS2的表达水平而对患者预后产生积极影响。

GO富集结果显示，“地榆-生甘草-槐花”防治右半结肠癌的靶点主要富集于类固醇代谢过程等条目上。研究表明，硬脂酰辅酶a脱饱和酶（SCD-1）在结肠癌干细胞中存在高表达现象，其可将饱和脂肪酸转化为不饱和脂肪，而典型方药中槐花关键成分白桦脂醇可通过抑制SCD-1而发挥对肿瘤干细胞的杀伤作用[34]。

KEGG富集分析结果显示，“地榆-生甘草-槐花的作用靶点”主要富集于IL-17信号通路、VEGF信号通路及TNF信号通路。IL-17信号通路主要由IL-17及其受体（IL-17-RA）组合构成，Wang等[45]研究表明在动物模型中IL-17的表达上调与结肠癌的疾病进展和5-FU治疗耐药有关，而IL-17-RA可直接在转化的结肠上皮细胞内促进癌前病变的发展；IL-17-RA还参与激活ERK、p38 MAPK和NF-κB信号，并能促进APC基因的突变的结肠癌胞的增殖。在本研究中，“地榆-生甘草-槐花”的核心靶PTGS2、IFNG及MAPK3均富集于IL-17信号通路上，作用于核心靶点并调控该通路可能是该典型方药组合防治右半结肠癌的重要机制。另一方面，PTGS2及MAPK3还同时富集于VEGF信号通路和TNF信号通路，有文献报道VEGF信号通路及TNF信号通路均在结肠癌的发生发展中具有重要作用[37,46]。“地榆-生甘草-槐花”亦可能通过靶向相关靶点调控这些通路以起防治结肠癌的作用。

本研究表明中医临床诊疗中左半结肠癌组方以清热解毒、行气活血为特点，代表药物有壁虎、地榆等。代表药物核心组合有“浙贝母-猫爪草-桔梗”等，代表的典型药物搭配规律有“半枝莲-法半夏-陈皮”等。右半结肠癌组方以健脾益气、养血补血为特点，代表药物有红景天、熟地黄等。代表方药核心有“当归-黄芪”等，代表的典型药物搭配规律有“地榆-生甘草-槐花”等。同时，本研究通过网络药理学分析表明，左半结肠癌典型方药潜在抗癌机制主要涉及肿瘤耐药阻滞、抑制增殖及促进肿瘤凋亡，涉及的信号通路主要有PI3K-AKT信号通路；右半结肠癌典型方药潜在抗癌机制主要涉及抗肿瘤血管生成、促肿瘤凋亡等，涉及的信号通路主要为VEGF信号通路等。以上研究结果，可为指导中医辨证论治左右半结肠癌临床用药提供借鉴，同时为相关基础研究的开展提供理论依据。

本研究亦存在着一定不足：①本研究中所挖掘的方药规律主要基于临床实际使用情况，未根据患者服药后临床症状及体征的改变进行分析、随访及疗效评价，研究结果可为临床提供组方用药策略提供参考，但应根据临床实际情况灵活加减应用，同时对于左、右半结肠癌的有效方药策略制定仍需要在未来基于大样本数据进行进一步的深入挖掘研究。②本研究第二部分分析主要基于网络药理学，网络药理学数据库仍有不断更新的迭代的趋势，对于典型方药的机制探讨，在未来研究中建议尽可能纳入更多元的数据。③本研究网络药理学研究的相关结果虽可为相关基础研究的开展提供理论基础，但研究结果仍需要进一步的实验验证。

综上，现代医学认为左、右半结肠癌是两种不同的实质性疾病，本研究以左、右半结肠癌作为数据挖掘的切入点，分析左、右半结肠患者方药规律及其典型方药抗癌作用机制。相关研究结果可为中医药防治左、右半结肠癌的中医临床诊疗策略制定及相关基础研究开展提供参考。从中医学理论及临床实际深化对左右半结肠癌疾病的认识，同时促进中医精准辨证论治左右半结肠癌疾病的研究工作，对裨益病患具有较大的临床意义，值得进一步探索开拓。