指纹图谱及多成分定量结合化学模式识别法评价不同厂家消炎利胆片质量*

车贵娟，匡艳辉，刘晓秋，夏玉英，张传平，王德勤

（1.广州白云山和记黄埔中药有限公司 广州 510000；2.沈阳药科大学中药学院 沈阳 110015）

消炎利胆片是具有岭南特色的名优中成药，有清热、祛湿、利胆的功效，临床上常用于肝胆湿热引起的口苦、胁痛、急性胆囊炎、胆管炎。主要由穿心莲、苦木、溪黄草三种药材组成[1-3]。

消炎利胆片收载于《中华人民共和国药典》2020版一部，其中含量测定仅对穿心莲的两种内酯类活性成分进行含量测定，这种简单的质量控制模式是难以全面反映成品的质量。现对消炎利胆片进行含量测定的研究总共涉及到13个指标成分，其中绿原酸、咖啡酸为穿心莲和溪黄草共有成分，拉西多宁、表诺多醇、冬凌草甲素、表诺多星存于溪黄草R. serra(Maxim.)Hara[4-10]。各个厂家的消炎利胆片生产所使用原料可能不同，不能准确分析各个厂家之间质量差异，缺乏有效测定3种药材中代表性活性成分的方法。中药指纹谱可以体现中药制剂中化学成分和相对含量，但不能揭示出各成分可能的含量变化规律，多成分定量分析与指纹图谱相结合，可以更好的控制其质量[11]。化学模式识别技术与指纹图谱分析相结合，可以筛查样品之间质量差异的标志物，在现代中药及其制剂的质量控制研究中也得到了广泛的应用[12-17]。

本研究建立了消炎利胆片的HPLC指纹图谱，寻找各药材的特征成分，结合3种化学模式识别方法，评价样品之间的差异，筛选出质量差异标志物，为各厂家生产过程中质量控制提供参考。同时，本研究建立了可以同时检测3种药材中主要活性成分的色谱方法，为消炎利胆片的质量标准建立提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent1290高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；Waters2695高效液相色谱仪（沃特世科技有限公司）；Supfex JX-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm，天津万象恒远科技有限公司）；Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm，安捷伦科技有限公司）；Genie U12超纯水仪（上海乐枫生物科技有限公司）；KQ-600VDB型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BSA224S-SW电子天平（0.1 mg，德国Sartorius公司）；CP225D电子天平（0.01 mg，德国Sartorius公司）。

1.2 试剂

乙腈（默克（德国）制药公司，色谱纯）；甲酸（上海安谱实验科技股份有限公司，色谱纯）；水（Genie U12超纯水仪制）；其它试剂均为分析纯（广东广试试剂科技有限公司）。

1.3 标准物质

4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮（批号6533，纯度98.0%）；穿心莲内酯（批号5327，纯度96.9%）；4,5-二甲氧基铁屎米酮（批号6532，纯度98.0%）；新穿心莲内酯（批号8813，纯度98.0%）；14-去氧穿心莲内酯（批号8901，纯度98.0%）；Andropanoside（批号9633，纯度98.0%）均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。迷迭香酸（批号111871-202007，纯度98.1%）；脱水穿心莲内酯（批号110854-201710，纯度99.4%）；穿心莲（批号121082-201505）；苦木（批号121017-2001305）；溪黄草（线纹香茶菜，批号121488-201603）均购自中国食品药品检定研究院。

1.4 供试品

消炎利胆片样品共41批，来源于21个厂家，编号S1、S2、S10-S34、S36-S38属于广东省，编号S3、S4、S9、S40、S41属于吉林省，编号S5-S7、S39属于云南省，编号S8、S35属于广西壮族自治区。阴性样品共3批，来源于广州白云山和记黄埔中药有限公司。

2 方法

2.1 色谱条件与系统适应性实验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱：0-25 min，19% A；25-26 min，19-23% A；26-45 min，23% A；45-50 min，23-26%A ；50-60 min，26% A；60-66 min，26-32% A；66-85 min，32% A；流速为1 mL·min-1；进样量10 µL；检测波长225 nm；柱温为室温；理论板数按脱水穿心莲内酯峰计算应不低于3000。

2.2 混合对照溶液的制备

精密称取迷迭香酸、4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮、穿心莲内酯、4,5-二甲氧基铁屎米酮、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品适量，置同一容量瓶中，加适量甲醇溶解，稀释至刻度，用甲醇溶解定容，经0.22 µm微孔滤膜过滤，取续滤液作为对照品溶液（每1 mL分别含0.003165-0.2198 mg、0.02054-0.7132 mg、0.01600-1.111 mg、0.02540-2.940 mg、0.003456-0.4000 mg、0.003584-0.4148 mg、0.02056-2.038 mg）。

精密称取穿心莲、苦木、溪黄草对照药材各0.5 g，分别置3个具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇30 mL，密塞，称定重量，超声30 min（250 W，45 kHz），放冷，补足减失的重量，摇匀，经0.22 µm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取消炎利胆片样品10片，除去包衣，研细，取约0.3 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，密塞，称定重量，超声30 min，放冷，补足减失的重量，摇匀，经0.22 µm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度实验

取样品（S26），按“2.3”项制备供试品溶液，“2.1”项色谱条件进样6针，以4号峰作为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值。

2.4.2 稳定性实验

取样品（S28），按“2.3”项方法制备供试品溶液，“2.1”项的色谱条件下0、2、4、6、8、12、24 h进行测定，以4号峰作为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值。

2.4.3 重复性实验

取样品（S32），按“2.3”项分别制备6份供试品溶液，“2.1”项的色谱条件下测定，以4号峰作为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值。

2.5 含量测定方法学考察

2.5.1 专属性、耐用性实验

取3份阴性样品和样品（S27），按“2.3”项的方法分别制备各阴性样品溶液和供试品溶液。取各阴性样品溶液、供试品溶液和按“2.2”项制得的混合对照品溶液，按“2.1”项色谱条件进样，记录色谱图。

取上述供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别用“1.1”项两种品牌的色谱柱测定。

取上述供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，用同一根色谱柱分别在“1.1”项两种品牌的色谱仪上测定。

2.5.2 线性关系考察

取“2.2”项的不同浓度混合对照品溶液，以浓度（µg·mL-1）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。

2.5.3 稳定性实验

取样品（S28），按“2.3”项制备供试品溶液，“2.1”项色谱条件0、2、4、6、8、12、24 h分别进行测定。

2.5.4 准确度实验

取样品（S32），去除包衣，研细，精密称取9份，每份0.15 g，置具塞锥形瓶中，精密加入适量各对照品溶液，按“2.1”项色谱条件测定。

2.6 化学模式识别

采用SPSS 26.0软件，对32批样品中11个共有峰峰面积标准化处理，进行CA和PCA。其中CA采用系统聚类分析组间联接，平方欧氏距离作为样品的测量区间。

无监督分析在样品组间差异不明显，组内差异明显时，难以发现和区分组间差异；组间差异小时，样本量大的那组将会主导模型，避免这些问题就是采用有监督分析[18]。根据PCA和CA的分组结果，将32批消炎利胆片通过SIMCA 14.1软件进行有监督模式的OPLS-DA，筛选样品之间的差异标志物。

3 结果

3.1 消炎利胆片指纹图谱研究

3.1.1 方法学考察结果

指纹图谱方法的精密度、稳定性、重复性结果的RSD值均小于3%。

3.1.2 指纹图谱研究结果

取32批消炎利胆片，分别按“2.3”项方法制备供试品溶液，“2.1”项色谱条件测定。导出32批消炎利胆片的色谱图，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”得到了32批消炎利胆片指纹图谱和对照指纹图谱（图1），根据药材与消炎利胆片样品的对比图（图2）选择各药材中的主要成分且分离度较好的色谱峰作为共有峰，共标定了11个峰，进行相似度计算，结果见表1。

表1 消炎利胆片样品相似度

图1 32批样品的HPLC指纹图谱及其对照指纹图谱（R）

图2 药材与消炎利胆片的对比图

3.1.3 主要色谱峰的化学指认

采用对照品进行指认，按“2.1”项色谱条件进样，记录色谱图，比较各峰保留时间和紫外吸收光谱。消炎利胆片样品HPLC指纹图谱中共指认了8个峰，分别是迷迭香酸（2号峰）、4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮（3号峰）、穿心莲内酯（4号峰）、Andropanoside（6号峰）、4,5-二甲氧基铁屎米酮（8号峰）、新穿心莲内酯（9号峰）、14-去氧穿心莲内酯（10号峰）、脱水穿心莲内酯（11号峰）。

3.2 HPLC同时测定消炎利胆片中7种有效成分的含量结果

3.2.1 方法学考察结果

方法学考察结果表明，该方法专属性、线性、准确度、精密度、重复性、均良好，阴性样品无干扰，如图3、表2、表3所示。耐用性考察结果表明使用两种品牌的色谱柱各成分的分离度均达到1.5以上，两种品牌的色谱仪测定各成分含量差异在10%范围以内。

图3 混合对照品溶液（A）、阴性样品（B、C、D）及消炎利胆片供试品溶液（E）色谱图

表2 线性实验结果

表3 准确度、稳定性、重复性实验结果

3.2.2 样品含量测定

将“1.4”项41批样品按“2.3”项制备供试品溶液，“2.1”项色谱条件测定，计算各成分的含量。结果41批样品中穿心莲内酯含量为2.62-10.2 mg/片，新穿心莲内酯含量为0.869-5.73 mg/片，14-去氧穿心莲内酯含量为0.660-4.50 mg/片，脱水穿心莲内酯含量为1.50-8.99 mg/片，迷迭香酸含量为0.0266-0.791 mg/片，4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮含量为0-0.730 mg/片，4,5-二甲氧基铁屎米酮含量为0-0.171 mg/片。

3.3 化学模式识别

3.3.1 聚类分析（CR）

结果见图4，当类间距离为12时，消炎利胆片被分为3类。样品S5、S6、S7的相似度相对较低，聚类趋势与相似度评价一致。

图4 32批样品聚类树状图

3.3.2 主成分分析（PCA）

主成分分析结果表明，以特征值大于1为提取标准，得 到3个 主 成 分，PC1、PC2、PC3贡 献 率 为60.076%、13.567%、11.798%，累积贡献率为85.442%。

由表4成分矩阵可知，PC1中峰3、峰5、峰6、峰8、峰9、峰10贡献大；PC2中峰1、峰4贡献大；PC3中峰11贡献大。根据公式F=Zx×t（Zx原始数据标准化的标准化矩阵，t为标准化的正交特征向量矩阵）计算各主成分值[12]。分别以计算所得的F1、F2、F3建立样品分布散点图，如图5。PCA的样品分布与CA一致，S5样品离群较远，与相似度评价一致。

图5 PCA样品分布散点图

表4 PCA成分矩阵

3.3.3 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）

OPLS-DA所建立模型得到的关键指标R2、Q2在通常情况下大于0.5较好，且两者差值不大于0.2-0.3为好[19]。一般增加主成分也会增加R2、Q2值，当只有R2值增加，Q2值不再增加或减少，此时已拟合过度，应该终止计算新的主成分[19]。根据相关文献建立所得的模型的Rx2cum=0.791、Ry2cum=0.679、Q2cum=0.635，其差值较小，且大于0.5，说明2主成分对样品预测能力较强，该模型拟合较好。

基于11个共有峰构建32批不同地方消炎利胆片的OPLS-DA第1、2样品分布散点图（图6），样品聚集趋势明显，且与PCA、CA分析的结果相同。图7展示了OPLS-DA模型中1、2主成分的11个指标峰与样品之间的相关性，从图中可以看出峰3、峰4、峰11距原点较远。OPLS-DA模型中化学指标的VIP（Variable importance for the projection）值越大，其对于解释变量的贡献越大、差异相关性越高。以VIP ≥ 1为重要的变量，筛选发现峰4、峰11、峰3对批次间稳定性的影响较大，说明在生产中应对这3个峰给予高度重视。

图6 OPLS-DA模型第1、2主成分样品分布散点图

图7 OPLS-DA模型第1、2主成分载荷图

4 讨论

4.1 色谱条件的优化

本实验对比了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.2%甲酸水等几种不同的洗脱条件，将对照品溶液在波长190-400 nm间扫描后对比了205 nm和225 nm下样品的色谱图。样品在流动相为乙腈-0.1%甲酸水，检测波长为225 nm下各色谱峰达到基线分离，峰形对称，保留时间适中，分离度良好，即确定该洗脱方法和检测波长。同时本实验比较了提取溶剂为水、甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇和色谱柱温度为25℃、30℃、40℃时各色谱峰峰面积的差异。发现不同温度对各成分的影响不大，提取溶剂用乙醇或70%乙醇时不利于迷迭香酸的提取，水不利于生物碱和内酯的提取，70%甲醇时所得的供试品溶液中各成分的含量较高，且无絮状物及沉淀产生，即确定以70%甲醇作为其提取溶剂，柱温为室温。

4.2 PCA、CA、OPLS-DA及含量测定分析

通过对比指纹图谱相似度和CA结果，其中白云山所生产的消炎利胆片都聚在一类，还包括万年青、一力、嘉应、济民等主流品牌产品，这些厂家的产品相似度均较高，在0.98以上。部分批次的相似度低于0.98，通过含量对比发现，S12相似度低是因为脱水穿心莲内酯的含量较低，S1-S7相似度低主要是因为迷迭香酸、4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮、4,5-二甲氧基铁屎米酮等含量较低。CA中将S1-S3、S5-S6、S10分为一类，可能原因是这几批的穿心莲内酯的含量相对其它样品较低，与产地无关。而S33-S41因缺少苦木生物碱的含量，故没有纳入指纹图谱研究范围。PCA结合OPLS-DA发现4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯为样品差异性的质量标志物，与上述指纹图谱的研究结果相符，工艺生产中应注意3种成分的传递规律。有文献表明穿心莲内酯在长时间的高温环境下会降解成脱水穿心莲内酯等成分，工艺生产过程应该控制好穿心莲提取时的温度[20]。

S1-S41样品中都含有迷迭香酸，但含量差异较大，本研究也发现不同厂家的样品经70%甲醇提取后的液体颜色差异较大，溪黄草基原未明确可能是其原因之一，有相关文献也证明不同基原中迷迭香酸的含量和汁液颜色有一定差异[21-22]。S33-S41样品中有6批不含4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮，9批不含4,5-二甲氧基铁屎米酮，而两种成分均来源于苦木，生物碱作为苦木中主要的抗炎活性成分，其不同的药用部位含量差异较大[23]。以上说明消炎利胆片的原料有一定差异，应当注意该投料药材的来源、用药部位、生产工艺等。

4.3 展望

本研究建立的指纹图谱确定了11个共有峰，建立的含量测定方法对消炎利胆片的3味药材主要活性成分都进行了控制，为消炎利胆片中各成分的含量测定和生产工艺研究提供了参考，由于苦木和溪黄草中各成分含量差异较大，需进行质量传递规律研究的前提下，完善生产工艺，确定质量标准中各成分限量。

穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯是穿心莲中具有抗炎作用的活性成分，工艺生产时的温度将会导致两者的含量发生变化[24-26]。目前有文献报道穿心莲内酯对NO抑制的活性强于其分解产物脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯，总内酯的对NO抑制的活性又强于穿心莲内酯的对NO抑制的活性[27]。总内酯中各成分的比例，某个成分的缺失或低于某一值后是否会对抗炎作用产生影响还需进一步研究，同时需要对比两者及不同比例总内酯对炎症患者的治疗效果，以为工艺生产时更好的把控两种成分的含量提供依据，确保药物的一致性。

4种基原的溪黄草的抗炎活性差异应进一步研究，找出具有代表性的抗炎活性成分控制其质量，明确其哪种基原作为消炎利胆片的原料更为合适，以保证药物的有效性。