葡萄籽提取物对复煮卤汤亚硝酸盐及生物胺的抑制作用
2022-03-03洪淑静孙杨赢党亚丽曹锦轩田宏伟潘道东
洪淑静,何 俊,*,夏 强,孙杨赢,党亚丽,曹锦轩,田宏伟,虞 挥,潘道东,*
(1.宁波大学食品与药学学院,浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室,浙江 宁波 315800;2.湖北周黑鸭企业发展有限公司,湖北 武汉 430000;3.浙江五莲农牧科技有限公司,浙江 丽水 323000)
卤鸭制品是鸭肉深加工的主要产品之一,也是深受消费者喜爱的酱卤肉制品。卤煮是酱卤制品生产工艺中的一个重要工序,多次循环卤煮可以促进风味物质的释放和附着,增强酱卤鸭制品的风味。经反复使用的卤汤俗称老汤[1],老汤富含游离氨基酸、核苷酸等可溶性风味物质,能够赋予肉制品醇厚的滋味。然而,老汤富含营养的同时也为一些有害物质的富集提供了条件。如在酱卤肉的加工过程中,美拉德反应和脂质氧化会产生特殊的醛、酮等化合物,自由基诱导的脂质和蛋白质氧化可能会导致形成胺类有害物[2];蒸煮、腌制等传统烹饪方式和烹饪时间对酱肉制品及卤汤有害成分(如亚硝酸盐、胺类等)的产生具有显著影响,并且随着复煮次数增多,有害成分呈现不断富集的趋势[3-4],这些都给卤汤及卤煮制品的安全性带来极大的挑战。
亚硝酸盐是广泛用于加工肉制品中的人工合成类食品添加剂,具有抑制肉毒梭状芽孢杆菌生长、形成腌肉的特征粉红色和风味等重要作用,已成为肉制品加工过程不可完全替代的食品添加剂[5]。然而在加工过程中亚硝酸盐可能会转化为对人体具有潜在致癌性的反应产物(亚硝胺),长期食用富含亚硝酸盐的食品会增加高铁血红蛋白症和癌症的发生几率[6]。根据GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》规定,酱卤肉制品中亚硝酸盐残留量不可超过30 mg/kg。食品中的生物胺主要是在微生物作用下氨基酸脱羧或醛酮氨基化形成的碱性含氮化合物,适量的生物胺可以参与激素、生物碱、核酸和蛋白质的合成及表达,对机体免疫更新、代谢以及温度调节都有重要作用[7-8],但浓度过高可引起头晕、恶心、高血压、偏头痛、皮肤过敏等问题;此外,生物胺还能作为亚硝胺的前体物质诱发癌变[9]。在肉类、肉制品及其副产物中,生物胺的含量能反映肉类变质程度,可作为食品变质的有效指标[10]。老汤富含生物胺前体物质[11-12],在实际生产中,老卤汤通常每天使用数次并连续使用,隔夜贮藏期间汤中的各类前体物质可经微生物作用产生生物胺,在不断复煮过程中逐渐积累并通过卤汤体系吸附和渗透到卤肉中,造成安全隐患。因此,降低卤汤中亚硝酸盐和生物胺的含量,开发天然抑制剂并探明其抑制机理具有重要的意义。
有关酱卤制品有害成分的控制研究多从改进加工工艺、控制前体物质及寻求亚硝酸盐替代物等方面入手[13-14],且已有研究表明部分天然植物提取物对食品中亚硝酸盐和生物胺的累积有明显的抑制作用[15-17]。葡萄籽提取物(grape seed extract,GSE)是从酿酒葡萄籽中提取出来的一种功能性物质,富含四聚物花青素等酚类化合物,具有强抗氧化、抗炎、抗癌、神经保护、降脂、抑菌等药理作用[18-19],能实现亚硝酸盐作为食品添加剂的部分功能。目前将GSE用于酱卤肉制品加工过程中以控制亚硝酸盐和生物胺积累的研究较少。因此,本研究以新鲜樱桃谷鸭为原料,在卤汤中加入不同添加量的GSE,借助模拟老卤汤卤鸭的生产过程,探讨GSE对卤汤中生物胺形成的影响及其抑制机理,为进一步抑制老卤汤中亚硝酸盐、生物胺的生成以及提高老汤的安全性提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
葡萄籽提取物 上海源叶生物科技有限公司;新鲜樱桃谷鸭 河南华英公司;调味料 宁波春晓农贸市场。
色胺、腐胺、苯乙胺、尸胺、酪胺、组胺、亚精胺、精胺标准品(均为分析纯) 北京中科质检生物技术有限公司;三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、高氯酸、乙腈、丙酮均为国产色谱纯,丹磺酰氯、氢氧化钠等均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
1260高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪 美国安捷伦公司;Milli-Q型超纯水制备系统 德国Merck公司;Micropro 2000 Reader酶标仪 瑞士Tecan公司;Allerga冷冻离心机美国贝克曼库尔特公司;M124A电子精密天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;XHF-D高速分散器宁波新芝生物科技公司。
1.3 方法
1.3.1 卤汤的制备
按照卤鸭的制作工艺[20],在不锈钢锅中加入3 L蒸馏水、1 kg腌制后的樱桃谷鸭、食盐3%(以蒸馏水质量计,下同)以及花椒、八角、桂皮、小茴香、陈皮均为0.3%的香料包。根据卤煮1 h前后水分的损失量和食盐的下降率,每次补足水分至3 L并加入2 g食盐对卤汤进行复原,每煮一次(1 h)后重新加入腌制后的鸭体和香料包进行下一轮卤煮。模拟实际生产中的复煮流程,每天按相同时间间隔完成4 次复煮,再经冷却置于4 ℃过夜贮藏,次日取出并重复间歇卤煮,直至卤汤重复使用21 次。从中选取6 个(第1、5、9、13、17、21次)具有代表性的取样点进行指标测定,待卤汤冷却至室温,将其真空包装后置于-80 ℃下冻藏待测。
1.3.2 实验分组
卤汤制作共分为4 组,每组3 个重复,除GSE添加量不同外,其余成分完全相同:第1组为空白组,不添加GSE;第2~4组分别添加0.01%、0.02%、0.03%(以蒸馏水质量计)的GSE。
1.3.3 亚硝酸盐含量的测定
参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的盐酸-萘乙二胺法测定亚硝酸盐含量。
1.3.4 生物胺的测定
参照Nie Xiaohua等[21]的方法并稍作修改,采用HPLC法测定生物胺含量。
标准溶液的配制:将色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺标准品制成1 mg/mL储备液备用。用0.4 mol/L高氯酸溶液将以上标准品储备液配成质量浓度梯度为0.5、1、2、5、10、20、50 μg/mL的混合标准溶液,于-20 ℃冰箱中包裹铝箔避光保存。
样品处理:取5 g卤汤向其加入20 mL 0.4 mol/L的高氯酸,冰浴匀浆,4 ℃离心(5 000 r/min、10 min)取上清液,沉淀重复提取一次。合并两次上清液,用0.4 mol/L的高氯酸溶液定容到50 mL。
标准溶液和样品的衍生化:取1 mL的混合标准溶液,加入200 μL 2 mol/L氢氧化钠溶液使之呈碱性,接着加入300 μL饱和碳酸氢钠溶液,然后加入2 mL 10 mg/mL的丹磺酰氯溶液,于40 ℃水浴条件下暗反应处理30 min后加入100 μL的氨水终止反应,去除残留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容至5 mL,经0.22 μm有机滤膜过滤,用于分析检测。
色谱条件:XBridge®C18反相柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱温40 ℃,流速1.0 mL/min,进样体积20 μL,紫外检测波长254 nm,流动相分别为水(A相)和乙腈(B相)。洗脱程序见表1。
表1 HPLC流动相洗脱条件Table 1 Mobile phase conditions for high performance liquid chromatography
1.3.5 游离氨基酸含量的测定
参考陶正清等[22]的方法并稍作修改。取4 mL卤汤于离心管中,加入20 mL磺基水杨酸溶液(30 g/L),于8 000 r/min下匀浆30 s。匀浆完毕后,将离心管于5 000 r/min下离心15 min,小心取出,吸取上清液4 mL,并加入2 mL正己烷,充分漩涡振荡混匀,用0.02 mol/L的盐酸溶液定容至50 mL,静置分层后用0.22 μm滤膜过滤,用氨基酸自动分析仪检测游离氨基酸含量。
1.4 数据处理与分析
使用SPSS软件进行显著性分析和相关性分析,并采用Origin 9.0软件作图。用单因素方差分析法对数据进行分析,采用Duncan’s对差异显著性进行判断,P<0.05表示存在显著差异。采用Pearson法进行相关性分析。
2 结果与分析
2.1 添加葡萄籽提取物对卤汤亚硝酸盐含量的影响
由图1可知,添加GSE组卤汤中亚硝酸盐含量的变化规律与空白组相似,随着卤煮次数的增加,亚硝酸盐含量呈上升趋势,在卤煮13 次后趋于平稳。卤煮结束后,添加0.01%、0.02%、0.03% GSE组和空白组亚硝酸盐总量分别为3.44、3.29、2.70 mg/kg和4.28 mg/kg,添加组均显著低于空白组(P<0.05);与空白组相比,GSE添加量为0.03%时亚硝酸盐抑制率达到36.92%,表明GSE对卤汤中亚硝酸盐的累积有抑制作用,且GSE添加量越多,抑制效果越强。卤汤中亚硝酸盐主要来源于初始鸭体残留的亚硝酸盐,并随着卤煮次数的增加而积累,经过不断复煮卤汤体系达到稳定,部分亚硝酸盐可与卤汤中蛋白质、脂类等多种成分发生氧化反应转化为硝酸盐类[23],而使亚硝盐含量增长趋于平稳。添加GSE组的抑制作用可能与其强抗氧化性及抑菌性有关[24],GSE能够将亚硝酸盐还原为NO、N2等物质,且能抑制肠杆菌、芽孢杆菌、霉菌及微球菌等硝酸盐还原菌的生长,避免了硝酸盐到亚硝酸盐的转化,从而抑制了亚硝酸盐的进一步积累。Wang Yongli等[25]研究了植物多酚类(绿茶多酚和GSE)对干腌肉制品亚硝酸盐残留量的影响,结果表明GSE能显著减少亚硝酸盐的残留,与本实验研究结果相似,体现出GSE具备清除亚硝酸盐的能力。Riazi等[26]的研究也得出类似结论,通过向牛肉香肠样品中添加质量分数1%的葡萄渣,发现葡萄渣降低了实验组中亚硝酸盐含量,同时还减少了硫代巴比妥酸反应物含量和脂质氧化程度。
图1 不同GSE添加量下卤汤亚硝酸盐含量的变化Fig.1 Changes in nitrite content in reused brine soup with different amounts of grape seed extract
2.2 添加葡萄籽提取物对卤汤生物胺含量的影响
根据图2生物胺标准品HPLC的出峰时间和表2不同生物胺的线性分析结果,对卤汤中8 种生物胺进行定性及定量分析。
图2 生物胺混合标准品HPLC图Fig.2 High performance chromatographic profile of mixed standard solution of biogenic amines
表2 不同生物胺含量的线性分析结果Table 2 Linear equations for quantification of different biogenic amines
卤汤中生物胺的含量在循环卤煮期间呈波动性变化(图3)。与空白组相比,加入不同添加量GSE总体显著降低了卤汤中腐胺和酪胺的含量(P<0.05),但苯乙胺的含量总体没有明显的下降。如图3A所示,空白组初始苯乙胺含量为2.77 mg/kg,卤煮17 次苯乙胺含量最高,达到4.06 mg/kg;不同添加量GSE对苯乙胺影响不稳定,但总体而言,添加GSE组的苯乙胺含量较空白组低,对苯乙胺有一定的抑制作用。如图3B所示,随着卤煮次数的增加,空白组腐胺含量由0.14 mg/kg(1 次)增加至1.96 mg/kg(21 次),添加GSE能够明显抑制腐胺的生成。添加0.02% GSE组在卤煮13 次后对腐胺的抑制效果显著,腐胺含量显著低于空白组(P<0.05),此时抑制率达57.4%。卤煮21 次后,添加0.01%、0.02%、0.03% GSE组的腐胺含量分别比空白组低44.6%、11.5%、31.4%,表明GSE能有效抑制腐胺的积累。如图3C所示,GSE对酪胺有明显的抑制作用,与空白组相比,添加GSE组中酪胺含量随GSE添加量的升高而降低;添加0.03% GSE组对酪胺的抑制作用最强,且在卤煮第9、13次对酪胺含量降低率分别达到了64.1%、70.9%。但随着卤煮次数的增加,对生物胺的抑制作用有所减弱,
图3 不同GSE添加量下卤汤苯乙胺(A)、腐胺(B)、酪胺(C)含量的变化Fig.3 Changes in contents of phenethylamine (A), putrescine (B), and tyramine (C) in resused brine soup with different amounnts of grape seed extract
这可能与温度对GSE生物活性的影响有关[27],因此,在卤煮过程中可适量补充GSE,合理控制用量,以维持其抑制生物胺生成的效果。生物胺是一类具有生物活性、含氨基的低分子质量化合物,生物胺的产生主要缘于微生物对游离氨基酸的脱羧作用,GSE能够降低卤鸭加工过程中生物胺的含量可能与其可以有效抑制一些腐败菌(包括生物胺阳性菌)的生长有关[28-29],这可能归因于GSE中酚类化合物可以有效降低细菌总数和细菌多样性,通过抑制微生物生长及氨基酸脱羧酶的活性,从而阻止生物胺的形成[30]。本实验结果与Akan等[31]的研究结果类似,后者发现谷粮食品发酵过程中添加GSE组的总生物胺含量显著低于空白组,其中添加量为8%的GSE对腐胺、尸胺含量降低作用最显著,同时还发现GSE能提高产品的营养价值(矿物质、总酚含量和抗氧化活性)。
2.3 不同添加量葡萄籽提取物的卤汤中游离氨基酸含量的比较
续表2
不同添加量GSE对卤汤中17 种游离氨基酸含量的影响如表3所示。在卤煮过程中,GSE的加入导致各添加组总游离氨基酸含量存在显著差异,总游离氨基酸含量随GSE添加量的增加总体呈降低趋势(P<0.05)。在卤煮第9次后GSE组中谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、赖氨酸含量总体高于空白组,天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸含量低于空白组,其余氨基酸在GSE组与空白组之间总体差异不明显。卤汤中主要氨基酸为谷氨酸且占总量的比例相对稳定,在21.6%~25.9%之间波动,其次是天冬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸等,半胱氨酸和甲硫氨酸的含量最少,这与对水煮鸭的研究报道结果[32]基本一致。由表3可知,卤煮次数对卤汤中游离氨基酸含量的影响较大,除半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸和精氨酸外,其他氨基酸含量均发生明显变化,肌肉组织经过煮制在蛋白水解酶、氨肽酶的作用会生成游离氨基酸,使得游离氨基酸含量迅速升高。同时卤汤中反应产生的小分子物质等也会在高渗透压的作用下转移到鸭肉内,使游离氨基酸参与反应生成挥发性化合物从而导致含量下降[33]。
表3 不同GSE添加量下卤汤游离氨基酸含量的变化Table 3 Changes in contents of free amino acids in reused brine soup with different amounts of grape seed extract μg/g
结合图3和表3可知,经过第5次卤煮后,空白组酪氨酸含量先大幅下降后趋于稳定,酪胺含量开始升高后趋于平稳,GSE组的酪氨酸含量比空白组高,且酪胺含量显著低于空白组;GSE组苯丙氨酸含量变化趋势不稳定,但在第17次开始GSE组苯丙氨酸含量升高,苯乙胺含量有所下降。而苯丙氨酸、酪氨酸分别是苯乙胺和酪胺的前体物质,说明添加GSE可能抑制了苯乙胺、酪胺的产生途径[34],从而减少了氨基酸到生物胺的转化。朱倩颖等[35]也得出类似结论,其通过研究多香果对生鲜肉品贮藏期间生物胺及游离氨基酸含量的影响,发现空白组中作为前体游离氨基酸的苯丙氨酸、精氨酸含量减少,苯乙胺和精胺含量升高;而添加多香果组中苯乙胺、精胺含量下降,游离氨基酸含量上升。Liang Jingjing等[36]通过相关分析发现,发酵腐乳前体氨基酸含量与其对应的生物胺含量之间相关系数较小,但蛋白质代谢实际上促进了生物胺的形成,同时发现高浓度的氨基酸可以促进脱羧酶的表达从而影响生物胺的含量。一般来说,肉制品中的生物胺主要由氨基酸脱羧形成,因此认为卤汤中游离氨基酸含量可能影响生物胺的形成,从而促使生物胺在食品中的积累。此外,研究发现在卤制的加热过程中会发生一系列变化,如丰富蛋白质种类、积累大量的亚硝酸盐和生物胺,还会进一步导致生成N-亚硝胺[37]。
2.4 生物胺与游离氨基酸含量的相关性分析结果
对3 种生物胺及17 种游离氨基酸、总游离氨基酸含量进行相关性分析,结果如图4所示,3 种生物胺含量与卤汤中多种游离氨基酸含量呈显著相关。其中卤汤中苯乙胺含量与天冬氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、精氨酸含量呈极显著正相关(P<0.01);腐胺、酪胺含量均与天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸含量呈极显著正相关(P<0.01);但苯乙胺、腐胺、酪胺含量与酪氨酸含量呈极显著负相关(P<0.01),体现在卤汤中酪氨酸含量总体随卤煮次数增加减少,而3 种生物胺含量总体上升。Özdestan等[38]也报道了发酵谷物样品中游离氨基酸总量与腐胺、尸胺、精胺、亚精胺含量之间存在显著相关性。Dabadé等[39]的研究结果同样显示动植物食品中生物胺含量与多种氨基酸含量存在显著相关性,其中组胺含量和组氨酸含量之间及苯乙胺含量和苯丙氨酸含量之间正相关性最强。本实验中卤汤中酪胺含量与酪氨酸含量为极显著负相关(P<0.01),卤汤酪氨酸含量减少,酪胺含量有一定的上升,可能发生了酪胺的转化。不同样品之间游离氨基酸含量与生物胺含量的相关性可能会由于原料、食品添加剂还有食品加工方式的差异而不同。综上,GSE对卤汤中生物胺的抑制作用与相应游离氨基酸含量有关,可能与影响卤煮过程中前体氨基酸的积累有关,从而抑制了氨基酸到生物胺的合成。
图4 卤汤中生物胺与游离氨基酸含量的相关性Fig.4 Correlation between bioamines and free amino acid contents in brine soup
3 结 论
GSE对卤汤亚硝酸盐的积累总体上具有明显抑制作用,对亚硝酸盐抑制率随着葡萄籽添加量的升高而升高,添加0.03% GSE抑制效果较好。GSE对苯乙胺含量影响不稳定,对腐胺、酪胺总体有显著抑制作用;GSE组各游离氨基酸含量呈波动变化,3 种生物胺含量与卤汤中多种游离氨基酸含量存在显著正相关性,说明GSE对生物胺的抑制作用可能与前体氨基酸含量有关,从而影响了生物胺的生成途径。综上,添加GSE能有效抑制卤煮过程中亚硝酸盐和生物胺的积累,可用于提高卤汤的安全性。