宁夏枸杞尼古丁来源研究△

康志欣，刘赛，张春阳，徐常青*，陈秀红，赵光跃*

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.西宁海关技术中心 青海省食品安全研究重点实验室，青海 西宁 810001

枸杞子为茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium）植物宁夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果实，具滋补肝肾、益精明目之功效，为我国传统药食两用中药材，深受国内外广大消费者青睐[1-2]。近年来，宁夏枸杞种植面积不断增加，出口量也持续增长，2020 年上半年出口额已达4981 万美元，同比增长24.6%[3]。宁夏枸杞种植过程中病虫害种类多，为害严重，频繁使用农药使枸杞子农药残留风险较高[4]，这是导致枸杞子出口退货的最主要原因之一[3]。与此同时，我国枸杞子出口过程中还普遍面临贸易壁垒问题，其中农药残留限量标准不合理问题尤为突出[5]。2018 年，欧盟食品农药残留报告显示，出口欧盟的有机枸杞常被检出尼古丁，而尼古丁为欧盟有机标准禁止使用的农业投入品。在未阐明枸杞子中尼古丁来源的情况下，欧盟委员会于2019年10月22 日发布（EU）2019/1793 条例[6]，对进入欧盟市场的枸杞子临时增加官方控制和紧急管理措施，全面检测尼古丁（限量值＜0.01 mg·kg-1）[7]。这增加了出口企业的生产成本，延长了交货期，使枸杞子出口受到一定程度的影响。获得欧盟标准有机认证的枸杞生产企业在产品检测时，不问缘由，一律不得检出尼古丁，否则按生产过程中使用禁用物质处理，由此对诚信生产的有机枸杞企业造成很大困扰，对企业信誉造成极大负面影响。枸杞子中尼古丁来源问题亟待解决。

尼古丁（nicotine）又名烟碱，是一种普遍存在于茄科烟草属（Nicotiana）植物中的生物碱，茄科茄属（Solanum）、番茄属（Lycopersicon）、辣椒属（Capsicum）等多个属的植物中也可检出微量尼古丁[8-9]。对植物而言，尼古丁是响应外界刺激、适应环境而产生的防御性次生代谢产物，光照时间长、昼夜温差大、虫害侵染等均会诱导烟草合成、积累尼古丁[10-14]。宁夏枸杞属于茄科植物，花果同期，病虫害种类多，主要种植于我国西北干旱地区，日照时间长、温差大，具备尼古丁合成的内因和外因[4]。目前，业界对于枸杞子中尼古丁的来源存在2 种猜测：一是内源说，即宁夏枸杞作为茄科植物，本身具备合成尼古丁的能力，且生长环境有利于尼古丁积累；二是外源说，即宁夏枸杞种植过程中所用的有机肥或生物农药等投入品含有尼古丁，由此造成污染。

为此，本研究首先采集从未使用过投入品的野生宁夏枸杞和荒弃多年的宁夏枸杞根、茎、花、果柄和不同成熟度的叶、果实，检测尼古丁含量，明确在没有外源性污染的情况下，宁夏枸杞是否可内源合成尼古丁及尼古丁在宁夏枸杞各组织器官、不同成熟度叶片和果实中的分布规律；其次，采集人工种植的宁夏枸杞成熟果实及其生产过程中所用有机肥、生物农药等材料进行尼古丁检测筛查，以期调查、了解宁夏枸杞成熟果实及其生产过程所用投入品中尼古丁情况，分析可能的外源性尼古丁来源，为解析枸杞子中尼古丁来源及残留变化提供参考。

1 材料

1.1 无外源污染宁夏枸杞

宁夏枸杞样品于2020 年8 月采集于青海省格尔木枸杞基地、都兰县五龙沟野生枸杞林、都兰县诺木洪农场，由中国医学科学院药用植物研究所徐常青研究员鉴定为宁夏枸杞Lycium barbarumL.，采样时用冰袋保鲜，后期贮存于-80 ℃冰箱，备用。样品信息见表1。将采集的宁夏枸杞样品根据部位仔细分离，按照成熟度及组织部位分为根、茎、叶（大叶：叶长＞3.50 cm、中叶：2.00 cm ＜叶长≤3.50 cm、小叶：叶长≤2.00 cm）、花、果（青果、中果、红果）、果柄。

表1 宁夏枸杞样品信息

1.2 宁夏枸杞成熟果实及宁夏枸杞生产所用投入品

2019 年，收集124 份不同生产组织方式的宁夏枸杞干燥成熟果实样品，其中来自生产企业43 份、农场8 份、合作社19 份、农户54 份。与此同时，还收集到62份宁夏枸杞生产投入品，包括有机肥6份、印楝素20 份、除虫菊素18 份、苦参碱6 份、植物精油4份、石硫合剂2份、农用助剂6份。

1.3 仪器

无外源污染宁夏枸杞尼古丁检测仪器：QTRAP 6500 型超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）仪（美国AB SCIEX 公司）；MILLI-QA 型超纯水机（德国Merck Millipore 公司）；XSE 205DU 型分析天平（Mettler-Toledo公司）；5427R 型冷冻高速离心机（德国Eppendorf 公司）；MIX-200 型多管涡旋振荡器（上海净信实业发展有限公司）；JSP-100 型高速多功能粉碎机（永康市金穗机械制造厂）；WGL-230B 型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。

宁夏枸杞成熟果实及宁夏枸杞生产所用投入品尼古丁检测仪器：QTRAP 5500 型UPLC-MS/MS 仪（美国AB SCIEX 公司）；MILLI-QA 型超纯水机（德国Merck Millipore 公司）；XPE 205 型微量天平（Mettler-Toledo 公司）；SIGMA 3-30K 型高速台式冷冻型离心机（德国Merck Sigma公司）；QL-861型旋涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；NEVAP-45 型氮吹仪（美国Organomation 公司）；DTC-27型超声波清洗器（湖北鼎泰高科有限公司）；R-210 型旋转蒸发仪（瑞士Buchi 公司）；T-25 型均质仪（德国IKA公司）。

1.4 试药

无外源污染宁夏枸杞尼古丁检测试药：乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）均购于德国Merck 公司；乙酸（色谱纯，国药控股化学试剂有限公司）；尼古丁对照品（德思特生物技术有限公司，批号：DST180802-032，纯度＞98%）。

宁夏枸杞成熟果实及宁夏枸杞生产所用投入品尼古丁检测试药：乙腈（色谱纯，美国Merck 公司）；甲酸（色谱纯，天津市富宇精细化工有限公司）；乙腈（分析纯）、无水乙醇（分析纯）均购于西陇科学股份有限公司；尼古丁对照品（美国Sigma公司，批号：BCBW4394，纯度＞98%）。

2 方法

2.1 无外源污染宁夏枸杞尼古丁检测

2.1.1样品提取 将分拣后的样品烘干，打粉过60 目标准筛，再将粉末烘至恒重。取（50.00 ±2.50）mg 样品，加入70%甲醇水溶液600 μL；振荡5 min，静置1 min，重复操作2 次；4 ℃冰箱静置过夜，4 ℃、12 000 r·min-1离心5 min（离心半径为10.0 cm），取上清液120 μL上机。

2.1.2色谱条件 HSS T3 C18色谱柱（100 mm ×2.1 mm，1.8 μm），以0.04%乙酸水溶液（A）-0.04%乙酸乙腈溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～1.5 min，98%A；1.5～6.0 min，98%～5%A；6.0～8.0 min，5%A；8.0～8.1 min，5%～98%A；8.1～11.0 min，98%A）；流速为0.35 mL·min-1，柱温为40 ℃，进样量为2 μL。尼古丁对照品及样品UPLC图见图1。

图1 尼古丁对照品及无外源污染宁夏枸杞尼古丁UPLC图

2.1.3质谱条件 电喷雾离子源（ESI），喷雾电压5500 V（+），帘气压为35 psi（1 psi≈6.895 kPa），离子源气体1 压力为5000 kPa，离子源气体2 压力为6000 kPa，离子源温度为550 ℃，入口电压为10 eV，碰撞室出口电压为12 eV。MRM 参数：保留时间为3.25 min，Q1 Mass 为163.124 Da，Q3 Mass 为130.0 Da，去簇电压为30 eV，碰撞能为30 eV。

2.1.4标准曲线 制备0.2、0.5、2.0、5.0、20.0、50.0、200.0、500.0、2 000.0 ng·mL-19 个不同质量浓度的溶液，用于UPLC-MS/MS 分析。以对照品质量浓度为横坐标（X），外标峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。标准曲线回归方程为Y=85 940.3X+12 607.757 62（r=0.992 53）。

2.2 宁夏枸杞成熟果实及其生产所用投入品尼古丁检测

参照GB/T 20769—2008 方法[15]，改进并建立宁夏枸杞成熟果实及其生产所用投入品尼古丁检测方法。

2.2.1样品提取 将固体样品（有机肥、石硫合剂等投入品）及冷冻后（-80 ℃放置48 h）的宁夏枸杞成熟果实研磨细粉，过35 目标准筛，混匀，备用。固体样品称取5 g（精确至0.01 g），液体样品（生物农药、助剂等投入品）量取5 mL（精确至0.01 mL），于50 mL 离心管中，加入无水乙醇15 mL，15 000 r·min-1均质提取1 min，超声提取20 min，5000 r·min-1离心5 min（离心半径为6.4 cm），取全部上清液于150 mL 鸡心瓶中；离心管中重复加入无水乙醇15 mL，匀浆提取1 min，4200 r·min-1离心5 min（离心半径为6.4 cm），取全部上清液与之前的提取液合并，提取液于40 ℃水浴旋转蒸发至1～2 mL，用氮气缓慢吹干，准确加入乙腈5 mL 涡旋混匀，超声2 min 溶解残渣，混匀，0.2 μm滤膜滤过。

2.2.2色谱条件 CAPCELL PAK C18IF2 色谱柱（100 mm×2.1 mm，2 μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～1.0 min，10%A；1.0～2.5 min，10%～45%A；2.5～3.0 min，45%～90%A；3.0～4.0 min，90%A；4.0～4.1 min，90%～10%A；4.1～5.0 min，10%A），流速为0.3 mL·min-1，柱温为40 ℃，进样量为5 μL。对照品及样品尼古丁HPLC图见图2。

图2 尼古丁对照品、宁夏枸杞成熟果实及其生产所用投入品尼古丁HPLC图

2.2.3质谱条件 ESI，喷雾电压5500 V（+），锥孔气流速为50 L·min-1，去溶剂气流速为55 L·min-1，气帘气流速为35 L·min-1，辅助气5500 kPa，离子源温度600 ℃，多反应监测（MRM）参数：保留时间为0.65 min，Q1 Mass 为163.2 Da，Q3 Mass 为130.0 Da（定量离子）、117.1 Da，去簇电压为75 eV，碰撞能为25、28 eV。

2.2.4标准曲线配制0.2、0.5、1.0、5.0、20.0、50.0 ng·mL-16 个不同质量浓度的溶液，用于HPLC-MS/MS分析。以对照品质量浓度（X）为横坐标，外标峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。标准曲线回归方程为Y=13 694.0X+3 065.8（r=0.999 83）。

3 结果

3.1 宁夏枸杞各组织器官尼古丁分布规律

宁夏枸杞不同组织器官中尼古丁含量（表2）检测结果显示，34 份样品中有15 份检出尼古丁，且质量分数均低于0.030 00 mg·kg-1。宁夏枸杞各组织器官中均有样品检出微量尼古丁，除花（0.029 13 mg·kg-1）和茎木质部（0.025 05 mg·kg-1）外，其他组织均未超过欧盟进口枸杞限量标准，尤其在果实中含量极低，不超过0.003 61 mg·kg-1。

表2 宁夏枸杞不同组织器官中尼古丁质量分数 mg·kg-1

3.2 宁夏枸杞不同成熟度叶片、果实尼古丁分布规律

宁夏枸杞不同成熟度叶片、果实中尼古丁含量（表3）检测结果显示，6 份叶片样品中均有检出尼古丁，检出率100%，12 份宁夏枸杞果实样品中有2 份检出尼古丁，检出率16.7%，且所有检出样品中尼古丁含量均低于欧盟进口枸杞限量标准。宁夏枸杞幼嫩叶片尼古丁含量相对较高，且宁夏枸杞果实也有近似趋势，但由于尼古丁含量太低，这种差异并不显著。

表3 不同成熟度宁夏枸杞叶片、果实中尼古丁质量分数 mg·kg-1

3.3 宁夏枸杞成熟果实及其生产所用投入品尼古丁调查

本研究共检测了124 份宁夏枸杞成熟果实样品（表4），其中21份检出尼古丁，检出量为0.000 55～0.030 30 mg·kg-1，样本总检出率为16.94%。其中农户的样品检出最多，检出率为20.37%，尼古丁最高质量分数为0.027 80 mg·kg-1；合作社样品的检出略低于农户，检出率为26.32%，尼古丁最高质量分数为0.030 30 mg·kg-1；然后依次为农场样品和公司样品，其尼古丁检出率分别为12.50% 和9.30%。在21 份检出尼古丁的枸杞子样品中，其中有7 份样品的尼古丁含量超过欧盟进口枸杞限量标准，1份来自公司，2份农户，4份合作社。

表4 宁夏枸杞成熟果实中尼古丁质量分数

本研究共检测62 份宁夏枸杞生产常用有机肥和生物农药等投入品（表5），所有有机肥、石硫合剂和农用助剂均未检出尼古丁，但有14份生物农药检出尼古丁，检出量为0.000 92～21.900 00 mg·kg-1，检出率为29.17%。苦参碱全部检出尼古丁，尼古丁质量分数最低为20.400 00 mg·kg-1，最高为21.900 00 mg·kg-1；除虫菊素虽可检出尼古丁，但含量远低于苦参碱，尼古丁质量分数最高为0.057 40 mg·g-1，检出率为44.44%。在14 份检出尼古丁的投入品中有8 份检出量超过欧盟进口枸杞限量标准，2 份来自同一厂家、同一采集单位的除虫菊素，6 份来自同一厂家，3 个不同采集单位的苦参碱。

表5 宁夏枸杞生产所用投入品尼古丁质量分数

4 讨论

尼古丁是茄科烟草类植物的代表性次生代谢产物[16]。研究发现，常见茄科蔬菜包括番茄属、茄属和辣椒属植物根、茎、叶、果实中均可检出尼古丁，其质量分数为0.019 40～16.060 00 mg·kg-1[17-19]。本文研究结果显示，在无外源污染情况下，宁夏枸杞的根、茎、叶、花、果中也可检出尼古丁，但含量极低。尤其是宁夏枸杞的果实，干果尼古丁质量分数均不超过0.003 61 mg·kg-1，显示宁夏枸杞也可以内源合成尼古丁，但具体合成机制有待进一步研究。宁夏枸杞叶片和果实中尼古丁含量均呈现随叶片或果实成熟而降低的趋势，与Siegmund 等[18]的研究结果一致。还有研究表明，烟草中尼古丁由根系合成并经茎木质部运输至地上部分[20]。本研究发现宁夏枸杞茎木质部中尼古丁含量高于茎韧皮部，推测宁夏枸杞的尼古丁合成和运输机制与同科植物烟草类似。

宁夏枸杞成熟果实及其生产所用投入品抽检结果显示，124 份果实样品中有7 份样品尼古丁检测结果超过欧盟进口枸杞限量标准。溯源结果显示，其中4 份合作社样品在枸杞生产过程中均使用过同一公司生产的苦参碱农药。。该公司生产的苦参碱农药检测结果显示，其中的尼古丁含量非常高。在保证无外源污染的情况下，宁夏枸杞果实中检出痕量尼古丁，仅荒弃地枸杞幼嫩青果及中度成熟果实中检出不超过0.003 61 mg·kg-1的尼古丁，这一含量甚至远低于一些人类日常大量食用的茄科果蔬，如茄子、辣椒、土豆和西红柿[9，18]。本文研究结果显示，枸杞子作为保健品食用时，其中所含天然尼古丁的摄入量远低于日常食用果蔬时的尼古丁摄入量。枸杞子尼古丁检测超标的最主要原因是外源污染所致。

随着国内外消费市场对枸杞子质量要求的不断提高，越来越多枸杞生产者开始种植生产绿色、有机枸杞，种植过程中会优先选用低毒的生物源农药进行病虫害防治。由于生物源农药防治效果不如化学药剂，使得个别不法厂商在生物源农药中违法加入其他成分以提高药效、增加销量，如本研究中苦参碱农药中检出高浓度的尼古丁就属于典型的非法添加隐性成分。因此，枸杞生产企业应建立并完善投入品采购的风险管控及溯源机制，生产中选择正规厂家的产品并签订产品质量协议。同时，枸杞生产还需贯彻生产全程植保的理念，优化病虫害防治方法、改进施药工具并把握防治关键期，预防为主，防治结合，以提高生物农药的防治效果。

由于宁夏枸杞可自身合成尼古丁且种植过程具备多种促进其合成积累尼古丁的条件，如日照时间长、昼夜温差大、病虫害严重、施用氮肥多等[4]，因此枸杞子中检出痕量的尼古丁是合理的。此前，“牛肝菌频繁检出尼古丁事件”也引发了行业关注，证实其可内源合成尼古丁后，欧盟最终决定对食用菌尼古丁实施新的限量标准[21-22]。据此，建议深入研究宁夏枸杞中尼古丁代谢合成机制、广泛调查宁夏枸杞中天然尼古丁含量范围，以期设置科学合理的枸杞子尼古丁限量标准，同时监控生物农药质量，及时反馈，建议和提醒广大枸杞种植者合理选择及使用合规的生物源农药，促使枸杞产业向好发展。