枸杞叶新资源药材的生药学研究△

邹立思，李会伟，严辉*，赵雪琴，郭盛，宿树兰，康宏杰，段金廒

1.南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心/国家中医药管理局中药资源循环利用重点研究室/江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏 南京 210023；2.宁夏枸杞创新中心，宁夏 银川 750002

枸杞叶为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarumL.、枸杞L.ChinenseMill.的干燥叶，始载于《名医别录》，具有补虚益精、清热明目的功效，主治虚劳发热、烦渴、目赤昏痛、障翳夜盲、崩漏带下、热毒疮肿[1]227。有研究表明，枸杞叶中富含多糖类、多酚类、甜菜碱、维生素及多种微量元素等资源性化学成分[2-5]，具有抗氧化、抗疲劳、降血糖、调血脂、抗癌等多种生物活性[6-9]。宁夏枸杞叶的活性成分在种类上与宁夏枸杞果实基本一致，部分成分含量甚至高于宁夏枸杞果实，展现出较好的资源价值和应用前景[2]。

枸杞叶作为宁夏地方特色药材和饮片收载于《宁夏中药材标准》[10]、《宁夏中药饮片炮制规范》[11]，名为枸杞茶，在相关标准中仅涉及部分性状及显微特征描述，尚缺乏系统的生药学研究。因此，本研究以宁夏枸杞叶为研究对象，从原植物形态、药材性状和微性状特征、显微特征等方面入手，开展其生药学研究，并建立其薄层色谱鉴定及主要成分含量测定方法，为宁夏枸杞叶新资源药材的开发利用提供重要参考，同时也为宁夏枸杞叶药材质量标准的建立提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

EOS 70D型、EF 100 mm f/2.8 USM型单镜头反光式数码相机（佳能株式会社）；Eclipse E100 型生物显微镜（尼康株式会社）；0030 型高温烘箱（苏州巨兴烘箱设备有限公司）；KD-3368AM 型切片机（金华市科迪仪器设备有限公司）；2695 Alliance 型高效液相色谱系统（含四元泵溶剂系统、在线脱气机和自动进样器）、2424 型蒸发光散射检测器（ELSD）、EmpowerTM色谱工作站软件（美国Waters公司）；ATS4-192264型薄层扫描仪（全自动点样仪、ADS2-192020 型全自动展开仪、Visualizer-192142 型数码成像系统，瑞士Camag 公司）；BT125D 型电子分析天平（塞多利斯公司）；Milli-Q 型超纯水制备仪（Milli-Pore 公司）；KQ-250E 型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；Anke GL-16GⅡ型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试剂

对照品甜菜碱（批号：1125A022，纯度＞98%，北京索莱宝科技有限公司）；对照品芦丁（批号：Y24F11Y17051，纯度＞98%，上海源叶生物科技有限公司）；对照品绿原酸（批号：110753-202018，纯度≥96.1%，国家食品药品检定研究院）；分析纯甲醇、乙酸丁酯（南京化学试剂有限公司）；分析纯甲酸、色谱纯乙腈、色谱纯甲酸（德国Merck 公司）；硅胶G 薄层色谱板（批号：HX383895，德国Merck公司）；超纯水为实验室自制。

1.3 样品

20 批宁夏枸杞叶样品于2017 年7 月分别采集于内蒙古、宁夏、甘肃、青海等区域，经南京中医药大学段金廒教授鉴定均为宁夏枸杞Lycium barbarumL.的叶，样品信息见表1。样品收集后，晾干，粉碎，过40目筛，4 ℃保存备用。

表1 枸杞样品信息

2 方法

2.1 性状鉴别

结合文献对宁夏枸杞原植物、药材性状特征进行描述和图片拍摄[10-11]。取宁夏枸杞叶药材浸泡至叶片舒展，采用徒手切片法制片，在10 倍镜下观察，并旋转粗、细准焦螺旋调至拍摄部位清晰，拍摄药材表面照片并记录其微观性状特征。

2.2 显微特征鉴别

选取宁夏枸杞新鲜叶片的中间叶脉外延部位并修整，于FAA 固定液（50%乙醇90 mL、甲醛5 mL、冰乙酸5 mL）中固定12 h，固定后的材料依次置于体积分数分别为70%、80%、90%、95%和100%的乙醇中脱水1 h，脱水后的材料经二甲苯溶液透明后浸蜡包埋，蜡块用石蜡切片机切成厚度约为15 μm的蜡带，选取较好的单个放于载玻片中间位置，放置温箱中5 h 后，用二甲苯进行脱蜡，而后采用番红-固绿进行二重染色，使用无水乙醇脱水。用中性树胶封片。封好的切片放于烤箱干燥12 h 以上；取宁夏枸杞的新鲜叶片，用镊子分别撕取上下表皮制作成水装片；通过水合氯醛透化和稀甘油装片法制作宁夏枸杞叶药材粉末装片。利用光学显微镜观察制片各部位组织结构及特征，拍摄组织显微照片，记录其显微特征及数据。

2.3 薄层色谱鉴别

2.3.1对照品溶液的制备 分别取对照品芦丁、绿原酸适量，精密称定，分别加甲醇制成质量浓度为1 mg·mL-1的对照品溶液。

2.3.2供试品溶液的制备 取枸杞叶样品粉末（过四号筛）2.0 g，加入甲醇20 mL，静置30 min，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL 使溶解，溶液用石油醚（60～90 ℃）振摇提取2 次，每次10 mL，弃去石油醚液，水液用正丁醇萃取2次，每次10 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2 mL溶解，作为供试品溶液。

2.3.3薄层色谱鉴别 参照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版（四部）通则0502 薄层色谱法[12]，吸取供试品溶液和芦丁、绿原酸对照品溶液2～5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（7∶4∶2.5）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇试液，待乙醇挥干后，置紫外光灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与2 种对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。

2.4 含量测定

2.4.1色谱条件及系统适用性 色谱柱：GRACE Prevail Carbohydrate ES型色谱柱（250 mm×2.1 mm，5 μm）；流动相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～7 min，25%A；7～17 min，25%～45%A；17～18 min，45%～25%A；18～20 min，25%A）；流速：1 mL·min-1；柱温25 ℃；进样体积：5 μL；ELSD 条件：漂移管温度：80 ℃，载气流量：2.5 L·min-1。色谱图见图1。

图1 宁夏枸杞叶样品及甜菜碱对照品HPLC-ELSD图

2.4.2对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的甜菜碱对照品适量，加入超纯水配制成质量浓度为1.6 mg·mL-1的对照品储备液，在4 ℃条件下贮藏。

2.4.3供试品溶液的制备 取各样品粉末约0.5 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入超纯水20 mL，55 ℃超声（250 W，40 kHz）提取60 min，加水补足减失质量，摇匀，10 638×g离心10 min，取上清液，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液。

2.4.4方法学考察

2.4.4.1线性关系考察与检出限 取适量体积的甜菜碱储备液稀释后，加纯水溶解制成质量浓度为1.603 mg·mL-1的对照品储备液，加水依次稀释成1.603 0、1.282 0、0.961 8、0.641 2、0.320 6、0.160 3 mg·mL-1系列质量浓度的对照品溶液，分别按2.4.1项下条件进样分析，以对照品质量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程Y=3×106X-3×106（r=0.997 2），线性范围为1.6～16.0 μg。并分别在信噪比（S/N）为3 和10时测定相应的检测限（LOD）和定量限（LOQ），分别为0.17、0.33 ng·mL-1。

2.4.4.2精密度试验 取对照品溶液，按照2.4.1项下色谱条件连续进样6 次，峰面积的RSD 为1.12%，表明精密度良好。

2.4.4.3重复性试验 取枸杞叶样本（S20）6 份，每份0.5 g，平行制备供试品溶液，分别按2.4.1项下色谱条件进样分析，分析6 份样品含量的RSD 为2.09%，表明重复性良好。

2.4.4.4稳定性试验 取枸杞叶样本（S20），分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定。结果表明，峰面积的RSD为1.27%，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.4.4.5加样回收率试验 取枸杞叶样本（S20）6份，精密称定，加入与样品中含量等量的对照品，按2.4.1项下色谱条件进样分析，计算回收率和RSD。结果表明，回收率为95.23%～105.83%，RSD 为5.26%，表明回收率良好。

2.4.5含量测定 取供试品溶液，按2.4.1项下色谱条件依次进样分析，测定峰面积，计算甜菜碱的含量。

3 结果

3.1 植物形态

野生宁夏枸杞为落叶灌木，人工栽培者呈树状大灌木。栽培者高0.8～2 m，茎粗者直径达10～20 cm；小枝弓曲而树冠多呈圆形，有纵棱纹，灰白色或灰黄色，无毛而微有光泽，有不生叶的短棘刺和生叶、花的长棘刺。叶互生或簇生，披针形或长椭圆状披针形，顶端短渐尖或急尖，基部楔形，略带肉质，叶脉不明显。花在长枝上1～2 朵生于叶腋，在短枝上2～6 朵同叶簇生；花梗长1～2 cm，向顶端渐增粗。花冠漏斗状，紫堇色。浆果红色或橙色，果皮肉质，多汁液，广椭圆状、矩圆状、卵状或近球状。种子略呈肾脏形，扁压，棕黄色。花果期较长。宁夏枸杞原植物、长枝及花、新鲜叶分别见图2～4。

图2 宁夏枸杞原植物

图3 宁夏枸杞长枝及花

图4 宁夏枸杞新鲜叶

3.2 性状

3.2.1性状鉴别 宁夏枸杞叶呈狭披针形或披针形，偶有倒卵形，略皱缩，长1.8～6.0 cm，宽0.5～1.0 cm，上表面黄绿色，下表面浅绿色，均不见毛。顶端短渐尖、急尖或圆钝，基部楔形，叶肉稍下延，全缘，主脉向下稍隆起，侧脉不明显，质脆，叶柄长0.3～0.5 cm，略呈绿褐色（图5）。气微，味淡。

图5 宁夏枸杞叶药材形态

3.2.2微性状鉴别 宁夏枸杞叶上表面有深纵沟，中脉下陷，叶脉上偶见短小腺毛分布，叶柄及叶肉下延部分的边缘呈半透明状，骨白色；叶下表面有浅纵沟，突起的中脉表面有多数断续的细纵棱，其横切面的下表面呈圆锯齿状。短小腺毛在叶柄上表面较密，下表面偶见，呈小棒槌状，黄棕色（图6）。

图6 宁夏枸杞叶药材微性状特征

3.3 显微特征

3.3.1叶横切面特征 上表皮和下表皮细胞各1列，类方形；表皮细胞外侧平周壁呈角质化，中脉及叶边缘处的表皮细胞角质层呈细齿状。上、下表皮偶见短小腺毛。叶肉组织不分化，均为栅栏组织，不通过中脉；上表皮下方1 列栅栏组织较为明显，排列较密，其余栅栏组织不明显，细胞间隙大且多。叶肉组织中可见草酸钙砂晶囊及砂晶，偶见簇晶和方晶。中脉下方突出，维管束双韧型，近上表皮处具厚角组织（图7～8）。

图7 宁夏枸杞叶横切面显微组织

图8 宁夏枸杞叶横切面显微特征

3.3.2叶表面特征 表皮细胞较大，排列紧密。上表皮细胞多角形，垂周壁平直或略弯曲；下表皮细胞不规则形，垂周壁弯曲。下表皮气孔分布较上表皮密集，以不定式气孔为主，偶见不等式。上表皮气孔保卫细胞长40～50 μm，宽11～15 μm；下表皮气孔保卫细胞长36～51 μm，宽12～15 μm，均为肾形，含有大量叶绿体，副卫细胞3～5个（图9）。

图9 宁夏枸杞叶表面显微特征

3.3.3粉末特征鉴别 淡绿色。草酸钙砂晶散在，或存在于叶肉组织中，形成草酸钙砂晶囊。上表皮细胞表面观呈多角形，垂周壁平直或弯曲；下表皮细胞不规则形，垂周壁弯曲；上下表皮均有气孔，以不定式为主，偶不等式，副卫细胞常3～5 个。有环纹导管，直径8～12 μm。纤维（叶柄）多成束存在（图10）。

图10 宁夏枸杞叶药材粉末显微特征

3.4 薄层色谱鉴别

采用《中国药典》2020 年版（四部）薄层色谱法对药材进行薄层色谱鉴别试验，通过CAMAG 摄影系统拍摄照片。

以芦丁和绿原酸为对照品，置紫外灯（365 nm）下观察；样品色谱中在与芦丁对照品色谱相应的位置上，均显黄色荧光斑点，在与绿原酸对照品色谱相应的位置上，均显蓝色荧光斑点，比移值（Rf）为0.4～0.6，见图11。

图11 宁夏枸杞叶药材的薄层色谱图

3.5 甜菜碱含量测定

枸杞叶各样品测定结果见表2。结果表明，20批宁夏枸杞叶中甜菜碱平均质量分数为4.856%。按照药材质量标准制订通用要求，参照本研究20 批不同产地样品检测结果，将宁夏枸杞叶药材中甜菜碱质量分数拟定为不低于3.90%，20 批宁夏枸杞叶药材全部符合此标准。

表2 不同产地宁夏枸杞叶中甜菜碱质量分数（， n=3）mg·g-1

表2 不同产地宁夏枸杞叶中甜菜碱质量分数（， n=3）mg·g-1

4 小结与讨论

枸杞产业是宁夏回族自治区党委和政府确定的九大重点发展产业之一，也是我国西北地区重点发展的富民产业。随着对枸杞资源研究的深入和枸杞市场需求的增长，枸杞叶资源的研究与开发越来越受到关注和重视。枸杞叶富含黄酮类、酚酸类、多糖类及甜菜碱等资源性化学成分，且含量较枸杞子高，是一种资源利用价值高和资源化前景广阔的药食两用资源品种，值得深入研究与开发[13]。而目前对于宁夏枸杞叶的生药学研究及质量控制尚显欠缺。本研究通过对宁夏枸杞叶的性状和微性状、显微特征、薄层鉴别特征及主要活性成分定量分析等进行较为系统的研究，制定了客观的、可操作的性状鉴别方法、显微鉴定方法及理化鉴定方法，为宁夏枸杞叶药材质量控制及开发利用提供了依据。

本实验在《宁夏中药材标准》[10]、《宁夏中药饮片炮制规范》[11]基础上对宁夏枸杞叶作了更完整和详尽的性状和显微特征描述，补充了宁夏枸杞干燥叶颜色、倒卵形、叶端急尖和圆钝、叶柄绿褐色等性状特征；首次描述枸杞叶的微性状特征，提出叶柄上表面密布的小棒槌状腺毛和叶中脉下表面圆齿状的典型鉴别特征；补充了叶表面观和粉末鉴别中不等式气孔类型、气孔保卫细胞大小、上下表皮细胞平周壁、导管、纤维等的特征；详述了叶横切面中栅栏组织的特征，并以横切面图完整呈现了所有关键特征，从生药学研究角度为枸杞叶质量标准的完善与提高提供了支撑。

宁夏枸杞、枸杞的嫩茎叶均可作为枸杞叶的基原[1]227，如《上海市中药材标准》[14]里仅将枸杞的嫩茎及叶作为枸杞叶基原，并规定春、夏采收，但由于其主要为野生资源，分布区域、生长年限、采收时间都很难明确，品质差异大且资源量不稳定，考虑其质量控制的稳定性及后续产业化前景，故本研究仅针对广泛栽培、生产过程更为规范、资源量更为充裕的宁夏枸杞进行研究。

研究表明，宁夏枸杞叶中甜菜碱含量均远高于枸杞子中报道的甜菜碱最高含量（1.02%）[15]，宁夏枸杞叶中甜菜碱含量也高于花中甜菜碱含量（1.88%）[16]，并且不同产地宁夏枸杞叶中甜菜碱含量并无明显差异。甜菜碱具有转甲基、调节渗透压、抗应激、调节脂肪、蛋白质、氨基酸代谢等功能，在工业生产中常作为新型饲料添加剂广泛应用[17-18]，可为宁夏枸杞叶开发为甜菜碱提取原料药提供思路。同时，本课题组将进一步采用中药资源化学研究思路和方法，全面评价其各类型资源性化学成分，并采用整体动物模型和体外细胞模型开展宁夏枸杞叶的活性评价及作用机制研究，为全面制订宁夏枸杞叶药材标准，发掘宁夏枸杞叶的资源价值与产业化开发提供支撑，服务于西部地区中药资源产业的高质量发展。