黄精的显微红外成像光谱鉴别研究△

高韵，司雨柔，解玫莹，李欢欢，章鹏飞，庄新港，程旺兴*

1.安徽中医药大学 药学院/现代中药安徽省工程技术研究中心，安徽 合肥 230012；2.中国电子科技集团公司 第四十一研究所，安徽 蚌埠 233010

黄精为百合科（Liliaceae）黄精属（PolygonatumMill.）多年生草本植物。全球黄精属植物分布有60 多种，其中我国该属物种资源丰富，种类约占全球的50%。黄精根茎可入药，具有较丰富的药用价值，且其味甘，性平，营养价值较高[1-2]。现代药理研究显示，黄精中含有多种活性成分，如甾体皂苷、黄精多糖、醌类、氨基酸及微量元素等，具有止血、抑制肾上腺素引起的血糖升高、抗氧化、抗疲劳和抗病原微生物等药理作用[3-4]。正是由于药用价值和食用价值高，黄精的临床用量较大，目前市场常有伪品混用。而黄精属内的物种比较丰富，性状特征相似，导致鉴别较为困难，给用药安全造成隐患。因此，需要可靠的技术对黄精进行鉴别，以保障其使用的安全性和可靠性。目前，黄精的鉴别方法主要包括性状[5]和显微鉴别[6]、分子鉴别[7]、指纹图谱鉴别[8]等。由于鉴别人员的经验及植物样本的差异，性状鉴别结果的正确性难以得到保证。其他仪器分析鉴别技术发展迅速，但是中药化学成分组成极为复杂，药材复杂的前处理不仅繁琐而且可能会破坏药材的成分，不一定能够反映其真实信息。

显微红外成像技术是一种新型检测技术，能更直接地表达复杂物质的空间组成成分及空间结构信息[9-10]。该法可以获得被测物质任意部位的红外光谱图像，通过对图像的分析可以得到该位置处所含物质的多种信息，如分子结构、主要官能团及在该部位的含量分布等。对红外成像图进行分析时，需选择某一化学官能团的特定红外吸收波长，以该波长处的红外吸收强度特征对应相应的官能团在该部位的空间分布[11]。目前，此项技术已用于刑事侦查、材料学[12]、地质学[13]等领域，在生物和医学方面的研究也有一定程度的进展，但鲜少应用在中药鉴别研究中。与传统技术相比，显微红外成像技术可以简化样品制备过程，无分离提取等复杂处理方法，减少对样品成分的破坏[14]。因此，本研究使用显微红外成像技术对黄精进行鉴别研究。

1 材料

1.1 仪器

Nicolet iS10 MX 型傅里叶红外光谱仪（Thermo Fisher Scientific公司，包括MCT/A型检测器）；BaF2窗片（13 mm×2 mm，森瑞科贸有限公司）；CM1850 UV型冰冻切片机（Leica 公司）；OMNIC 9.0 红外光谱分析软件（Thermo Nicolet公司）。

1.2 样品

黄精药材均经安徽中医药大学刘守金教授鉴定，具体信息见表1。

表1 黄精样品信息

2 方法

2.1 样品制备与测定

2.1.1红外光谱 将黄精干燥后粉碎，过80 目筛，取样品粉末适量，置于红外光谱-金刚石衰减全反射附件Smart iTR的金刚石表面，摊平，旋转附件旋钮将样品固定并压成透明薄片。红外光谱波数为4000～675 cm-1，扫描数为16次。

2.1.2显微红外成像光谱 采用冷冻切片机对新鲜黄精的根茎进行切片，切片厚度为30 μm。切好后转移至BaF2窗片上，将窗片放置载物台上并优化聚光镜高度。选择实验条件（透射，显微镜光栏为50 μm×50 μm，光谱波数为4000～675 cm-1，光谱分辨率为8 cm-1，扫描次数2 次），红外成像对选定的样品区域进行点对点作图，进而对样品进行扫描。

3 结果与讨论

3.1 不同产地多花黄精的显微红外图像研究

采用传统的傅里叶红外光谱法对不同产地的黄精进行分析，见图1。结果表明，不同产地多花黄精的主要吸收峰波数在3370、2920、2550、2150、1620、1410、1240、1018、930、860、811 cm-1附近，其中3400～3200 cm-1的强宽吸收峰是分子间以氢键O-H结合而产生的伸缩振动吸收峰[15]；2920 cm-1附近出现的中等强度信号峰为饱和C-H伸缩振动峰[16]；1410 cm-1附近为C-H 弯曲振动[17]；1300～550 cm-1为糖类、皂苷类等物质的特征性信号吸收区[18]。以上特征吸收峰的存在说明多花黄精中含有丰富的多糖及甾体皂苷类物质。《中华人民共和国药典》2020年版以葡萄糖作为对照品测定黄精中的多糖含量[19]，1018 cm-1附近的吸收峰为葡萄糖四氢吡喃环的C-O-C振动吸收峰，所以将1018 cm-1附近的吸收峰强度作为黄精化学成分中糖类含量的判断。由图1 可以看出，不同产地多花黄精均在1018 cm-1附近有明显吸收峰，仅有部分位置和形状发生变化，特征峰变化不明显，表明其主要化学成分的结构无明显区别，但成分含量可能有所差异。

图1 不同产地多花黄精红外光谱

采用红外光谱法仅能定性研究不同产地多花黄精的差异，灵敏度不高，不能直观体现其化学成分的差异。采用显微红外成像光谱测定7 个不同产地多花黄精样品，见图2。结果表明，不同产地黄精样品多糖含量和分布有明显差异。不同产地多花黄精的多糖类成分在皮层均有所分布，以贵州省铜仁市样品的多糖含量最高，且主要分布在下部中心位置；其次为黄山市祁门县和湖北省赤壁县样品，多糖类成分分布较为均匀；浙江省天目山样品的多糖类成分主要分布在皮层，由皮层至内部含量逐渐减少；湖南省怀化市和江西省瑞昌市样品多糖类成分总体分布较为均匀，且在外皮层有所积累；贵州省六盘水市样品多糖类成分含量最低，仅在外皮层有少量分布。不同地方地理形貌不同，受到不同地势的地理位置、经纬度、水肥、光照等环境因素的影响，使得不同产地的同一药材化学成分含量可能存在差异。吴其国等[20]发现，环境因子中活动积温与黄精多糖含量呈显著相关，故不同产地的温度差异也是造成多糖含量差异的因素。

图2 不同产地多花黄精显微红外图像

3.2 不同种黄精的显微红外图像研究

由图3 可知，不同种黄精的红外光谱主要吸收峰与不同产地多花黄精红外吸收峰类似，且黄精属各种之间吸收峰也大致类似，不能直观地看出其化学成分的差异。

图3 不同种黄精红外光谱

由图4 可知，不同黄精的多糖类成分含量具有差异。黄精中多糖类成分主要在皮层积累较多，内部也有分布，自皮层向内部逐渐减少；长梗黄精中多糖类成分大量积累在皮层位置，内部组织也有少量分布；轮叶黄精和滇黄精中多糖类成分主要分布在外皮层，内部基本组织也有分布，分布均匀但含量较少；多花黄精中多糖类成分含量较少，且主要分布在外皮层。程铭恩等[6]发现黄精属植物中仅黏液细胞里含有多糖类化合物，由于黏液细胞在不同属的黄精根状茎中分布和数目不等，所以黄精属植物的多糖类成分有明显差异。

图4 不同种黄精显微红外图像

4 结论

本研究通过显微红外成像光谱法，以多糖物质作为评价指标，对7种不同产地的多花黄精和5个不同黄精属植物进行鉴别研究。结果表明，不同产地多花黄精及不同黄精属植物之间多糖类成分有明显的差异。与传统傅里叶红外光谱技术和普通显微鉴别技术相比，显微红外成像技术可研究黄精主要成分在不同扫描微区的分布情况，既能对黄精植物根茎横切面的局部形状面貌进行显微成像，也能显示出根茎横切面空间各位置的红外光谱信息，使其不同形貌和含量分析表达更加直观，具有图谱合一、可视性高和灵敏度高的优点[21]。显微红外成像技术对中药材的研究具有直观、无损、快速的特点，使其在中药研究领域有很高的潜力和可实现性，也为中药材的鉴别和含量分析提供了新的思路。由于样品收集时间有限，故本实验研究的样本较少，在今后的工作中将加大样本量，并增加量化指标的检测，为本方法的应用提供更加充足的依据。