丛枝菌根真菌对黄瓜苗期枯萎病防治及生长的影响

杨 凡，牛莉莉，唐艳领，马 凯，王晨阳，米国全，孙天梅，史宣杰*

（1.河南省农业科学院园艺研究所，河南郑州 450002；2.河南农业大学，河南郑州 450002；3.邓州市农技推广中心，河南邓州 474150）

黄瓜具有良好的药用和食用价值，在我国有悠久的种植历史。目前，黄瓜种植已经成为农业中的主要组成部分和实现农民增收、农业增效、农村经济发展及乡村振兴的重要支柱，保障了市民“菜篮子”的生态健康、丰富多彩和有效供给。随着产业结构的调整和人们需求的增多，黄瓜种植面积和范围不断扩大，由此引发的连作频率增加，土传病害日趋严重，成为阻碍黄瓜生产的主要因素。黄瓜枯萎病素有“植物癌症”之称，具有全球性，是威胁黄瓜的主要土传病害之一[1]，在黄瓜整个生长期均能发病，发病率一般在10%～30%，严重时可达85%，甚至绝收，极大地制约了黄瓜的产量和品质[2-3]。目前，生产上主要以化学防治为主，但极易造成病原菌耐药、产品及土壤残留农药、微生物系统紊乱、生态环境遭破坏等诸多问题，严重地影响了黄瓜的安全生产和可持续发展。相比之下，利用微生物防治蔬菜病虫害，因成本低、来源广、环境友好等越来越受种植户青睐[4]。

近年来，人们采用木霉菌、芽孢杆菌等微生物抑制黄瓜枯萎病取得显著成效。高长敏等[5]研究发现木霉可以降低黄瓜幼苗膜脂过氧化，提高幼苗抵抗枯萎病的能力，促进幼苗生长。赵文娟等[6]实验结果表明，枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌对黄瓜枯萎病有明显的防效，主要是抑制病原菌菌丝和芽管的生长。路丹丹[7]利用龟裂链霉菌防治黄瓜枯萎病，可使病情指数下降到20.0，防效达72.1%。Moharam 等[8]通过利用印度梨形孢处理黄瓜种子，发现其可显著降低黄瓜枯萎病的发生率。丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）能寄生在地球上90%以上的陆生植物，通过菌丝及代谢产物促进植株发育、抵御病虫害等。有研究表明接种丛枝菌根真菌可以降低黄瓜根腐病、根结线虫的危害，但在黄瓜枯萎病及其苗期的研究鲜有报道[9-11]。

蔬菜育苗移栽是蔬菜生产上提高综合效益的关键技术[12]。中央一号文件及国务院联防联控机制多次强调要大力发展工厂化育苗，缩短蔬菜生长周期，夯实“菜篮子工程”[13]。本研究在育苗基质中通过添加有益微生物菌剂，研究丛枝菌根真菌与镰刀菌互作条件下黄瓜抗枯萎病及生理生化指标变化情况，从而在源头上探索抑制病害发生、提高商品苗率的措施，为丛枝菌根真菌防治黄瓜枯萎病及育苗壮苗技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试黄瓜品种为‘博杰605’，购自河南省庆发种业有限公司。

供试菌株AMF 为摩西球囊霉菌（Glomus mosseae，Gm3-2），黄瓜枯萎病病原菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.,FOX37-8），菌种由河南省农业科学院园艺研究所蔬菜设施与栽培研究室保存。

供试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基（PDA）和马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）。育苗基质由欧博亚泥炭、珍珠岩和蛭石自行配制，质量比为6∶3∶1，添加不同浓度的Gm3-2。

1.2 试验设计

试验于2020 年6—10 月在河南现代农业研究开发基地育苗温室车间内进行。试验设5 个处理，具体见表1。

表1 实验处理Table 1 Experimental treatment

黄瓜育苗采用40 穴穴盘育苗，30 盘为1 个处理，重复3 次。‘博杰605’种子催芽露白以后，采用106孢子/mLFOX37-8菌液浸种5 min，然后一穴一粒播种，其中CK1对照的种子采用无菌水浸种5 min。

1.3 摩西球囊霉菌Gm3-2 孢子的制备

采用灭菌的育苗基质（欧博亚泥炭∶珍珠岩∶蛭石=6∶3∶1），通过三叶草工厂化育苗扩繁3 个月，收集培养的摩西球囊霉菌育苗基质。取1 g 育苗基质配制成孢子悬浮液，用血球计数板记录悬浮液的孢子数，并将孢子悬浮液稀释成105、106、107孢子/g。按照1∶100（V悬浮液∶V基质）加入到配置好的育苗基质中，待用。

1.4 病原菌FOX37-8 孢子悬浮液的制备

将黄瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌FOX37-8在PDA培养基上25 ℃黑暗条件下培养3 d，从菌落边缘取直径5 mm 的菌饼3 块，接种在含有100 mL PDB 培养基的250 mL 的三角瓶中，25 ℃下250 r/min 振荡培养5 d，得到孢子悬浮液。用血球计数板记录孢子悬液的孢子数，并将孢子悬浮液稀释至106孢子/mL，备用。

1.5 测定指标与方法

试验于播种后15 d 取样进行黄瓜抗病性指标、幼苗质量指标及相关防御性酶指标的测定。

1.5.1 抗病性指标

抗病性指标包括植株发病率、病情指数和防治效果。黄瓜苗期枯萎病参照张素平[14]、宿晓琳等[15]的分级标准，0 级：无症状；1 级：真叶、子叶黄化或萎蔫面积不超过总面积的50%；2 级：真叶、子叶黄化或萎蔫面积超过总面积的50%；3 级：叶片萎蔫或枯死，仅生长点存活；4级：全株严重萎蔫，以致枯死。

病情指数和防治效果参照宗兆锋等[16]的计算方法，具体见式（1）（2）。

1.5.2 幼苗质量指标

幼苗质量指标包括茎粗、株高、根体积、地上部/地下部鲜质量或干质量、壮苗指数、叶绿素含量等。其中茎粗采用游标卡尺测定子叶节下1 cm 处的粗度；株高采用直尺测定黄瓜幼苗茎基部到生长点之间的距离；根体积采用排水法测定。

地上部/地下部鲜质量的测定：植株清洗干净，吸干表面水分，用1/1 000 电子天平测定鲜质量。植株鲜样在105 ℃杀青15 min 后，70 ℃烘至恒质量，用1/1 000 电子天平测定干质量。

壮苗指数参照张凯等[17]计算方法，具体见式（3）。

采用分光光度法测定植株叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素含量。

1.5.3 相关防御性酶指标

植株防御性保护酶如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）及丙二醛（MDA）等在植物抗逆抗病中起重要作用。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法测定；参照刘新[18]的方法测定植物防御性保护酶的酶活力，分别以D290nm、D470nm、D410nm值变化0.01 为1 个PAL、POD 和PPO 的酶活力单位，U；根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）还原法测定。

1.6 数据统计与分析

利用Microsoft Excel 2016 软件进行图表制作，利用DPS 7.05 进行数据显著性分析。

2 结果与分析

2.1 丛枝菌根真菌对黄瓜枯萎病抑制效果的影响

由表2（见下页）知，黄瓜播种15 d 后，接种摩西球囊霉菌Gm3-2孢子的黄瓜植株发病率、发病程度及防治效果和CK2 存在显著性差异。CK2 组的患病植株最多，叶片萎蔫，茎部缢缩有水渍浸出，生长缓慢或枯死，发病率高达96.4%。而接种摩西球囊霉菌Gm3-2孢子的黄瓜植株生长迅速，茎杆粗壮，患病植株较少，发病程度较弱。从发病率的角度看，接种107孢子/gGm3-2基质（A3）的黄瓜枯萎病发病率最低，仅有12.4%，对黄瓜枯萎病的防治效果达到80.3%；接种105孢子/g（A1）和106孢子/g（A2）Gm3-2基质的黄瓜枯萎病发病率分别为26.9%和13.2%。

表2 丛枝菌根真菌不同浓度处理对黄瓜枯萎病抑制效果Table 2 Control effect of AMF different treatments on cucumber fusarium wilt

2.2 丛枝菌根真菌对黄瓜壮苗指标的影响

从表3 可以看出，添加丛枝菌根真菌可以促进黄瓜幼苗生长，使其茎粗和株高都有所增加。处理A1、A2 和A3 茎粗分别比对照CK2 提高了11.22%、29.76%和26.10%，株高则分别增加了25.76%、34.62%和33.14%。未接种丛枝菌根真菌CK1 和CK2 间茎粗和株高均无显著性差异。处理A1、A2 和A3 壮苗指数皆高于对照CK1 和CK2，且均存在显著性差异，和未接种丛枝菌根真菌的CK1处理相比，壮苗指数分别提高了24.39%、46.34%和46.34%。这说明接种丛枝菌根真菌可以促进黄瓜幼苗生长。

表3 丛枝菌根真菌不同浓度处理对黄瓜幼苗质量的影响Table 3 Effects of AMF different treatments on quality of cucumber seedlings

2.3 丛枝菌根真菌对黄瓜幼苗根系的影响

接种丛枝菌根真菌的处理A1、A2 和A3，最大侧根长均大于10 cm，和未接种丛枝菌根真菌的CK1、CK2 处理存在显著差异，见表4。与CK2 最大侧根长相比，处理A1、A2、A3 和CK1 分别增加60.22%、62.45%、61.21%和20.57%。处理A2 根系活力最高，和CK1 和CK2 相比，显著提高46.30%和102.56%，说明丛枝菌根真菌可以促进黄瓜幼苗根系生长，提高黄瓜幼苗根系活力。

表4 丛枝菌根真菌不同浓度处理对黄瓜根系活力的影响Table 4 Effects of AMF different treatments on root activity of cucumber

2.4 丛枝菌根真菌对幼苗叶片色素含量的影响

接种丛枝菌根真菌处理的A1、A2 和A3，其黄瓜幼苗叶片叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素含量均高于未接种丛枝菌根真菌处理的（见表5）。当处理A2 接种浓度为106孢子/g 时，黄瓜幼苗叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素含量最高，且与对照相比差异显著。这表明丛枝菌根真菌可以促进叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素的合成，以106孢子/g 处理的最好。

表5 丛枝菌根真菌不同处理对黄瓜叶片叶绿素含量影响Table 5 Effects of AMF different treatments on chlorophyll content of cucumber seedling leaves

2.5 丛枝菌根真菌对黄瓜防御性酶活性的影响

从表6 可以看出，接种丛枝菌根真菌的处理A1、A2和A3，其黄瓜幼苗防御性酶PAL、PPO、POD 的酶活均高于未接种丛枝菌根真菌处理的。与CK2 相比，处理A1、A2 和A3 的PAL 活性分别高58.16%、82.32%和77.56%。而MDA 则显著低于未接种丛枝菌根真菌处理的，分别低42.31%、44.87%和44.13%。

表6 丛枝菌根真菌不同浓度处理对黄瓜防御性酶活性影响Table 6 Effects of AMF different treatments on activities of defensive enzymes in cucumber

3 讨论与结论

近年来，采用生防菌剂抑制黄瓜枯萎病取得了显著成效[5,15,19]。如朱廷恒等[20]试验表明木霉菌可以有效防治黄瓜枯萎病，其防效高达76%左右。徐韶等[21]采用枯草芽孢杆菌和木霉菌剂混合，防治甜瓜枯萎病效果极佳。大量研究表明，丛枝菌根真菌利用菌丝侵染植物根部形成共生，可以促进植物生长，增强其抗逆性和抗病性[9]。秦海滨等[22]接种丛枝菌根真菌后可以有效降低黄瓜苗期对立枯病的发病率，同时促进植物地上部和地下部生长。

本试验结果表明接种107孢子/g 的摩西球囊霉菌Gm3-2的黄瓜幼苗发病率仅有12.4%，对黄瓜枯萎病的防效达80.3%，防效和CK2 对照存在显著性差异。接种丛枝菌根真菌的处理A1、A2 和A3 幼苗茎粗和株高显著高于未接种丛枝菌根真菌的黄瓜幼苗，壮苗指数增加24.3%～87.5%。说明丛枝菌根真菌在和病原菌互作条件下，仍可促进黄瓜幼苗生长和壮苗，提高黄瓜商品苗的质量。

穴盘苗根系发育空间小，而黄瓜又属于浅根作物，能否持续稳定吸收基质水肥是培育壮苗的关键。根系活力是衡量植株健康生长发育的主要指标。接种不同浓度的丛枝菌根真菌均可以提高黄瓜幼苗的最大侧根长、根体积和根系活力。处理A2 最大侧根长和根系活力与CK2相比，分别增加了62.45%和102.56%，表明丛枝菌根真菌可以促进幼苗的根系发育，增大根系接触面积，提高黄瓜幼苗根系活力，加速根系对营养元素和矿物质的吸收，这对于培育黄瓜壮苗非常有利。

苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、多酚氧化酶及丙二醛等酶的活性可作为植物抗逆和抗病能力的生理指标。植株遭受逆境或受到病原菌攻击后，会诱导植物发生防御性反应，减少活性氧对植物细胞膜系统的破坏，提高植物免疫力[23]。本研究得出，接种丛枝菌根真菌的黄瓜PAL、POD 和PPO 防御酶活性相比未接种菌剂的黄瓜处理都有不同程度的提高，说明丛枝菌根真菌可以缓解黄瓜幼苗遭受逆境和病原菌的胁迫，有效提高黄瓜幼苗抗逆抗病能力。这和季倩茹等[24]利用芽孢杆菌防治黄瓜枯萎病结果基本一致。本实验接种丛枝菌根真菌的处理可以显著降低MDA 含量，减少病原菌或逆境条件下对植物细胞的伤害，这和高长敏等[5]利用木霉抗黄瓜枯萎病、降低丙二醛含量的结果一致。

丛枝菌根真菌可以在侵染植物根部大量繁殖，调节微生物环境，促生抗病。本试验模拟黄瓜生产中的育苗环节，研究了丛枝菌根真菌对黄瓜抗枯萎病及促苗壮苗的作用，结果表明当基质中丛枝菌根真菌孢子浓度为106孢子/g 时，丛枝菌根真菌可显著降低枯萎病原菌对黄瓜幼苗膜脂过氧化程度，抑制枯萎病的发生，促进壮苗，这为合理利用生物技术培育壮苗提供了科学方法。下一步将加大对丛枝菌根真菌在育苗过程中调控根部微环境、促生抗病机理方面研究。