斑马鱼动物模型在眼科中的应用研究进展

胡海坚张旭

(南昌大学附属眼科医院,江西省眼科学与视觉科学研究所,江西省眼科疾病临床医学研究中心,国家眼耳鼻喉疾病临床医学研究中心江西省分中心,南昌 330006)

斑马鱼已成为一种广泛用于研究脊椎动物发育、疾病遗传机制和药物毒理学的模式生物,其原因在于斑马鱼体外发育的胚胎透明,使发育的可视化成为可能[1-2]。 此外,斑马鱼世代时间很短,每周可产生约200 个后代,可以大量繁殖,并且易于维护,成本相对较低[3]。 而且,斑马鱼胚胎发育很快,大脑、心脏、肝、肠道和眼睛等大部分器官在受精后1 d 内发育并在7 dpf(day post fertilization,dpf)内发挥作用,胚胎在3 dpf 左右孵化并且可以自由游动,5 dpf 左右显示出功能性视觉[4]。 斑马鱼的眼睛与体型大小相比,相对较大,使得在早期胚胎发生过程中进行眼芽操作是可行的[1]。 同时,斑马鱼所具备的强大的视觉行为,包括视动反应、眼动反应、趋光反应,惊恐反应和逃避反应等,使视功能结果容易获得[5]。 基因组测序表明,71. 4%的人类基因及82%的人类致病基因至少有一种斑马鱼直系同源物[6]。 综上所述,斑马鱼已成为人类眼科疾病的良好的动物模型,并为进一步探究疾病发病机制和治疗方法提供新的见解。 本综述将介绍斑马鱼的眼部特征,斑马鱼动物模型在眼科疾病及药物疗效、药物眼毒性评估中的应用。

1 斑马鱼的眼部特征

斑马鱼眼睛在形态、生理、功能和基因表达上与人类眼睛相似,但同时也存在一些差异(见表1),以下将通过角膜、前房角、晶状体、视网膜和视神经等方面进行阐述。

表1 斑马鱼与人类眼部特征比较Table 1 Comparison of the eye features between zebrafish and human

1.1 角膜

斑马鱼和人类的角膜都包括五层:角膜上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和角膜内皮层。 而且与其他脊椎动物一样,斑马鱼角膜也是无血管的[7]。 但斑马鱼角膜与人类角膜相比也存在一定的差异,如角膜神经纤维缺乏,基质层厚度较薄等[8]。

1.2 前房角

大多数哺乳动物介导房水产生和清除的组织在前房角呈对称分布,房水主要通过前房角向四周流动[9]。 而斑马鱼房水从背侧睫状体上皮产生,流到腹侧管状网络和玻璃体-视网膜血管[10]。 虽然斑马鱼前房角的整体结构与哺乳动物不同,但睫状体上皮细胞和房水流出通路的细胞仍具有高度的保守性[10]。

1.3 晶状体

斑马鱼和人类的晶状体均由紧密排列的晶状体纤维组成,它们在前外周被单层晶状体上皮细胞包围[3]。 哺乳动物晶状体上皮细胞的末端位于晶状体赤道附近,而斑马鱼晶状体上皮细胞的末端则进一步向后延伸[3]。 此外,斑马鱼的晶状体形状也比人类更接近球形,几乎负责所有光折射,而其他脊椎动物大部分光折射由角膜完成[11]。 人类和斑马鱼中都有α、β 和γ 三种晶状体蛋白,晶状体蛋白的相似性使其成为研究活体动物晶状体的绝佳模型[12]。

1.4 视网膜

与人类相似,斑马鱼光感受器由视锥细胞和视杆细胞组成。 斑马鱼视锥细胞可分为蓝色、绿色、红色和紫外线敏感视锥细胞,因此斑马鱼的视觉是四色的。 而人眼缺乏紫外线敏感视锥细胞,只有三色视觉[5]。 虽然斑马鱼和啮齿动物都没有黄斑,但由于斑马鱼有白天活动的节律,而且视网膜以视锥细胞为主,因此具有良好的色觉[4]。 斑马鱼视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)密度大于大鼠和小鼠,具有较高的视力,因此更接近人类视觉[5]。 与哺乳动物不同,斑马鱼能够再生受损的视网膜,其再生的关键是Müller 胶质细胞,它能够分裂并产生多能视网膜祖细胞和再生主要的视网膜神经元[13]。

1.5 视神经

人类筛板前的视神经轴突没有髓鞘,筛板后的视神经轴突有髓鞘,而斑马鱼全部视神经轴突都有髓鞘,视网膜内轴突有松散的单层髓鞘,视神经轴突则由致密的髓鞘包绕[14]。 人类每只眼睛一半视神经纤维投射到大脑同侧,另一半穿过视交叉,投射到大脑对侧,而斑马鱼每只眼睛所有的视神经纤维都穿过视交叉并延伸到大脑对侧[15]。

2 斑马鱼动物模型在眼科疾病的应用

斑马鱼已广泛用于了解人类疾病相关基因的生物学活性,去除斑马鱼基因功能的方法包括基于吗啉代寡核苷酸(morpholino oligonucleotides,Mos)的基因敲除技术来影响靶基因的翻译或剪接、使用成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)及其相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)的基因编辑技术来实现靶基因的突变。 此外,一些基于药物、光照或机械损伤等诱因建立的斑马鱼动物模型在眼科疾病中也得到了良好的应用。 以下将对斑马鱼动物模型在角膜疾病、白内障、青光眼、视网膜疾病和视神经损伤等眼科疾病中的应用进行阐述。

2.1 角膜疾病

角膜营养不良是一组具有遗传异质性的疾病。人类MAB21L基因突变会导致角膜营养不良,斑马鱼mab21l1 基因突变表现为角膜变薄,并随着年龄的增长而发展,还表现为角膜细胞死亡增加,角膜转化为皮肤样上皮细胞[16]。 Zebrabow 是一组能够对整个生物体或特定的组织进行多色标记的转基因斑马鱼,有研究者使用Zebrabow 成功实现了角膜细胞的可视化和跟踪,这些发现对于深入了解这些细胞在角膜疾病如角膜缘干细胞缺乏症中的作用至关重要[17]。 此外,Ikkala 等[18]使用机械损伤的方法建立了一种可重复操作的斑马鱼角膜上皮擦伤模型,该模型中角膜上皮伤口可以快速愈合,具有强大的上皮再生能力,使其成为揭示角膜上皮再生具体机制的有用模型。

2.2 青光眼

青光眼疾病风险表型在斑马鱼中得到了很好的研究,低密度脂蛋白受体相关蛋白2(low density lipoprotein receptor-related protein 2,lrp2)基因突变的斑马鱼表现为成年发病的严重近视,眼球突出,眼压升高和进行性RGCs 死亡[19]。 细胞色素P450家族 1B1 ( recombinant cytochrome P450 1B1,CYP1B1)基因突变是原发性婴儿型青光眼常见原因,斑马鱼研究揭示了cyp1b1 基因是通过改变神经嵴迁移来影响眼前段的发育[20]。 Axenfeld-Rieger综合征(axenfeld-rieger syndrome,ARS)是一组眼前段发育不良,并可伴全身发育异常的疾病,而眼前节畸形常导致继发性青光眼,foxc1 和pitx2 基因突变斑马鱼可表现出ARS 眼相关表型[21]。 我们使用N-甲基D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)玻璃体腔注射或水浴建立了一种青光眼兴奋性毒性模型,表现为视网膜神经纤维层和RGCs 层厚度增加,而RGCs 数量减少[22-23]。 另有研究使用过氧化氢玻璃体腔注射建立了一种青光眼氧化应激模型,表现为RGCs 层凋亡细胞增加[24]。

2.3 白内障

白内障在老年人群中最为普遍,但具有遗传易感性的儿童也会发生先天性白内障。 斑马鱼晶状体蛋白基因突变体可表现为晶状体中可见散在圆形闪亮液滴或晶状体中央可见大小不规则的突起[25]。 转录调节因子包括热休克蛋白转录因子4(heat shock factor 4,HSF4)[26], 同源盒基因3(pituitary homeobox 3,PITX3)等基因突变可导致晶状体发育不良而引起晶状体混浊[27]。 晶状体膜蛋白包括水通道蛋白0(aquaporin 0,AQP0)[28],缝隙连接蛋白α8(gap junction protein alpha 8,GJA8)[29]等基因突变,可引起膜蛋白结构异常,导致细胞间营养物质运输和通讯障碍,晶状体发生代谢紊乱而混浊。 此外,在斑马鱼前房内注射过氧化氢,几乎可以立即形成高度不透明的白内障,且随着时间的推移,晶状体清晰度逐渐恢复[30]。

2.4 视网膜疾病

2.4.1 糖尿病视网膜病变

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常见的微血管并发症。 斑马鱼中参与糖代谢的器官如胰腺、肝等在进化上具有保守性,使其成为糖代谢研究的理想动物模型[31]。 斑马鱼暴露于2%和0%葡萄糖交替条件下1 个月后,血糖水平增加3 倍,内丛状层和外丛状层厚度增加,视网膜电图受损[32]。 缺氧用于模拟增殖性DR,斑马鱼在相对空气饱和度为10%的水中保持10 d,可导致视网膜新生血管和血管通透性改变[33]。 链脲霉素(streptozotocin,STZ)可通过破坏胰岛β 细胞而导致高血糖[34]。 斑马鱼腹腔内注射STZ,可引起血糖升高,表现出类似于人类DR 的视网膜退化[35]。 乙二醛酶1(glyoxalase 1,GLO1)缺失会导致甲基乙二醛水平升高和糖尿病表型,glo1-/-斑马鱼表现为空腹血糖水平升高,视网膜血管芽增加[36]。

2.4.2 年龄相关性黄斑变性

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)分为干性和湿性。 Saito 等[37]将斑马鱼暴露在高强度白光下,建立了一种干性AMD模型,表现为视网膜外核层厚度和细胞核数量减少,凋亡细胞增加,而抗氧化剂可有效逆转这些变化。 Cao 等[38]将斑马鱼暴露于不同浓度空气饱和水并分析血管生成反应,建立了一种血管生成与缺氧呈剂量依赖性关系的湿性AMD 模型,且抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)药物可阻断新生血管的生成。 丝氨酸蛋白酶1(high-temperature requirement factor A1,HTRA1)与AMD 有很强的遗传相关性,过表达htra1 基因的斑马鱼表现出视网膜色素上皮细胞形态变化,脂褐素积累和光感受器细胞死亡,这些特征与早期AMD相似[39]。 希佩尔-林道(von hippel-lindau,vhl)基因突变的斑马鱼在大脑、眼睛和躯干中形成严重的新生血管,出现视网膜新生血管、血管渗漏、黄斑水肿和视网膜脱离,而抗VEGF 药阻断了眼部的血管生成,提示vhl-/-斑马鱼是湿性AMD 的一个很好的模型[40]。

2.4.3 早产儿视网膜病变

早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,ROP)是婴儿失明的常见原因。 Wu 等[41]使用缺氧诱导剂建立了斑马鱼ROP 模型,表现为视网膜血管出现更多的分支和芽,血管渗漏增加,且与缺氧诱导剂呈剂量依赖性关系,而VEGF 抑制剂可减轻新生血管生成和渗漏。 缺氧是病理性新生血管形成的关键驱动力,而视网膜新生血管生成是DR、AMD和ROP 的共同特征,因此缺氧可作为这些疾病的共同诱因[33,38]。

2.4.4 视网膜色素变性

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是一组视杆细胞退行性疾病。 视蛋白视紫红质(rhodopsin,rho)基因突变的斑马鱼表现为视杆细胞在发育后不久即出现退化并持续到成年,而视锥细胞不受影响[42]。 人类USH2A基因突变是RP 的常见原因,其中最常见的两个突变均位于第13 号外显子,外显子跳跃是指一个外显子和它两端的内含子被剪接而不出现在成熟mRNA 中。 基于MOs 技术的第13 号外显子跳跃后的斑马鱼可恢复正常的蛋白质表达和视觉功能,该研究为RP 等遗传性疾病的基因治疗提供了可能[43]。 N-甲基-N-亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea,MNU)是一种烷化剂,可将其甲基转移到核酸上,导致DNA 突变和损伤,MNU诱导的斑马鱼可产生类似于RP 的视杆细胞退化[44]。

2.4.5 先天性色觉障碍

先天性色觉障碍也称为色盲,是由视锥细胞特异性光转导机制或离子通道的异常改变引起,并阻止视锥细胞将信息传递给下游神经元。 生物钟基因2(period2,PER2)是一种光调节基因,per2 基因突变的斑马鱼表现为视网膜带状突触结构异常,视锥细胞视蛋白表达降低,视功能下降[45]。

2.5 视神经损伤

视神经损伤(optic nerve injury,ONI)也称为外伤性视神经病变。 与哺乳动物不同,斑马鱼中枢神经系统具有很强的神经再生能力,可在ONI 后完全恢复视觉功能,RGCs 及其轴突再生是主要原因[14]。Diekmann 等[46]构建了生长相关蛋白(growth associated protein-43,GAP-43)启动子调控绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达的转基因斑马鱼,该模型可在ONI 后,显著诱导GFP 高表达于RGCs 及其轴突,使轴突再生的可视化成为可能,并且该模型与基因敲除或药物处理相结合,可以分析轴突再生过程中的信号级联反应和特定蛋白的作用。 还有研究者使用GFP-微管相关蛋白1 轻链3(microtubule-associated protein 1 light 3,LC3)转基因斑马鱼,观察ONI 后不同时间点的RGCs 及其轴突的自噬反应,并且证明了自噬参与RGCs 及其轴突再生的过程,而自噬抑制剂可以促进轴突再生,这些证据表明自噬反应可作为中枢神经系统再生的潜在治疗靶点[47]。 因此,进一步明确斑马鱼视神经再生机制,有望为人类视神经损伤等疾病治疗提供新的见解[48]。

2.6 其他

斑马鱼还广泛应用到其他眼部疾病的研究中。眼皮肤白化病2(oculocutaneous albinism 2,OCA2)基因突变患者头发、皮肤和眼睛的黑色素色素沉着下降,斑马鱼oca2 基因突变表现为皮肤、视网膜色素上皮、虹膜载黑素细胞数量下降,黑色素产生减少[49]。 性别决定相关基因簇2(sex-determining region Y-box 2,SOX2)基因突变占人类无眼症或小眼症等出生缺陷的20%,斑马鱼sox2 基因突变导致眼部发育缺陷,引起无眼症或小眼症,类似于人类SOX2 基因缺陷的表现[50]。

3 斑马鱼动物模型在药物疗效和眼毒性评估中的应用

3.1 斑马鱼动物模型在眼科药物疗效评估中的应用

斑马鱼动物模型为筛选治疗眼部疾病的药物提供了可能。 由于斑马鱼的眼睛与人类的眼睛的相似性,并且斑马鱼还表现出强大的视觉行为,使其成为视网膜变性疾病如AMD、RP 等疾病的药物筛选的合适的动物模型[51]。 缺氧诱导的斑马鱼视网膜新生血管模型被用于测试抗VEGF 药物的作用,该药逆转了视网膜新生血管[38]。 此外,抗VEGF 药物阻断了vhl-/-斑马鱼眼部的新生血管生成[40]。 高强度白光诱导的斑马鱼干性AMD 模型中,抗氧化剂可以有效逆转视网膜的退行性改变,且与药物浓度呈剂量依赖性[37]。 这些研究表明斑马鱼可以作为新药疗效评估的有效工具。

3.2 斑马鱼动物模型在药物眼毒性评估中的应用

斑马鱼可作为一种临床前阶段预测药物眼毒性的动物模型。 在一项研究中,3 dpf 的斑马鱼暴露于6 种已知具有眼毒性的药物2 d 后,其中5 种药物导致斑马鱼视觉功能受损,从而证实了这些药物对人眼的潜在毒性[52]。 由于许多药物表现出较差的水溶性,需要有机溶剂来溶解以保证适当的生物利用率,斑马鱼胚胎可作为评估有机溶剂眼毒性的良好动物模型[53]。 此外,斑马鱼还可作为小分子的筛选工具,有研究使用斑马鱼胚胎成功从大约2000种小分子中筛选出4 种在特定浓度下会影响视网膜血管形态的小分子[54]。 这些研究表明斑马鱼成功地反映了药物眼毒性的特征,并可作为预测新药眼毒性的工具。

4 结语

视力障碍是世界范围内的主要健康问题,疾病相关发病机制的理解对于开发新的治疗方法至关重要。 许多人类视觉障碍相关的表型已在斑马鱼中重现,斑马鱼动物模型有助于了解人类疾病的发病机制,为更好的诊断、治疗开辟途径。 此外,斑马鱼还广泛用于眼科药物疗效和药物眼毒性的评估中,成为筛选新药越来越有吸引力的模型。 虽然斑马鱼眼睛在形态、生理、功能和基因表达上与人类相似,但在某些情况下,斑马鱼的基因功能差异,足以破坏斑马鱼突变体和人类疾病综合征的表型相似性,并且斑马鱼的生理学差异也会使疾病模型复杂化。 而且与哺乳动物相比,斑马鱼在解释人类眼科疾病,以及评估眼科药物疗效和药物眼毒性时,通常需要面临更大的挑战。 尽管斑马鱼可能存在这些不足之处,但其仍然是广泛用于人类眼部疾病和药物评估的良好动物模型。 未来,基因治疗技术的发展,以及进一步明确斑马鱼视网膜和视神经再生的关键参与者,有望为人类眼部疾病治疗提供新的见解。

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