基于“心脾同治”理论探讨益气活血方调控冠心病气虚血瘀证大鼠炎症反应的机制

王瑾茜喻嵘李薇杨蕙张田田蔺晓源胡国恒陈亚雷诗卉*

(1. 湖南中医药大学第一附属医院,长沙 410007;2. 湖南中医药大学,长沙 410208)

冠心病(coronary heart disease, CHD)是我国导致死亡的主要原因之一[1],美国心脏协会的一项研究表明,由于衰老、吸烟及其他风险因子的影响,到2030 年,中国的CHD 患者复发和死亡的风险将增加3.3 倍[2]。 现代医学研究证实,免疫炎症反应在CHD 的发生发展中起重要作用[3]。 脾作为机体最大的免疫器官,含有大量的巨噬细胞[4-5]。 脾来源的巨噬细胞活化后,可吞噬大量胆固醇从而转变为泡沫细胞,后者积聚于血管内膜形成脂质斑块,进而加速CHD 的进程。 上述过程被认为是促进炎症反应、加速动脉硬化斑块形成的关键所在[6-7]。CHD 在中医学中归属于“胸痹”、“心痛”等范畴[8]。中医学认为心脾两脏存在“母子相及”的关系,并认为心、脾两脏相互为病,是胸痹心痛的内在病机之一[9]。 《金匮要略》一书中首次提出“心脾同治”之法,认为脾与心存在母子相及的关系,膏脂的生成转化与脾的运化功能密切相关,脾虚可加重脂浊生成,脂浊浸淫血脉则血脉壅滞,遂发为胸痹心痛[10]。有研究证实了脾虚证患者免疫功能降低,导致机体炎症反应加重,进而加速了胸痹心痛的进程[11]。 亦有研究表明,脾虚患者血管内皮易损、修复能力减弱,使胸痹心痛的易患性增加[12]。 结合现代医学及中医视角,课题组认为,“心脾同治”治法的科学依据可能与调控脾介导的免疫炎性反应失衡密切相关。

益气活血方是湖南省名老中医胡国恒教授的经验方,临床治疗CHD 疗效显著[13]。 全方由黄芪、当归、丹参、川芎四药组成。 黄芪性温,补气而使脾阳复辟。 当归性温味甘,养血合营。 两者合用,体现“若实其脾,则化得其正”的用药精髓。 丹参可破宿血,补新生血;川芎为血中气药,可使血闭者能通。 诸药相互为用,共奏心脾同治、气血并补之效,是“心脾同治”法的具体体现形式。 本研究中,我们采用“游泳力竭+控制饮食+结扎冠状动脉左前降支”制备CHD 气虚血瘀证病证结合动物模型,观察益气活血方干预后大鼠一般状态及血清中白介素-35(interleukin-35,IL-35)、白介素-37(interleukin-37,IL-37)的改变,检测脾组织、心肌组织及主动脉病理形态及IL-35、IL-37 的平均光密度及蛋白含量表达,以期探寻益气活血方调控CHD 气虚血瘀证炎症反应的机制所在,为“心脾同治”理论提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

16 周龄SPF 级雄性SD 大鼠30 只,体重(280 ±20)g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司【SCXK(湘)2019-0004】。 饲养于湖南中医药大学第一附属医院SPF 级动物房【SYXK(湘)2020-0010】。 实验动物饲养条件为:18 ～ 21℃,湿度保持40% ～ 70%,环境空气控制为每分钟10 次换气;保持每天12 h 光照和12 h 黑暗环境。 本文涉及动物实验,均经湖南中医药大学医学伦理委员会监管和批准实施(IACUC20201010-3),实验过程遵循3R 原则。

1.1.2 主要试剂与仪器

益气活血方由黄芪30 g,当归12 g,川芎15 g,丹参15 g 组成,中药饮片购自湖南中医药大学第一附属医院。

注射用青霉素钠(华北制药,86347),IL-35 ELISA 测定试剂盒(FY2081-A)、IL-37 ELISA 测定试剂盒(FY2083-A)均购自于江苏菲亚生物科技有限公司;DAB 显色液(北京中杉金桥,ZLI-9018),总蛋白提取试剂盒(22865-23)、酶标二抗(23876-26)、ECL 显色液(21278-34)均购自于默克美国sigma 试剂公司。

酶标仪(Perkinelmer,Enspire,美国),小动物呼吸机(奥尔科特,ALC-V10,中国),电子天平(湘仪,TP-2200B,中国),台式冷冻离心机(贺默,Z32HK,德国),水浴锅(Blue pard,DK-8AD,中国),心电图机(徕卡,BL-420,德国),荧光显微镜(奥林巴斯,BX43,日本),生物组织包埋机(宏业,BM-VⅢ,中国),手动轮转式切片机(赛默飞,HM325,英国),染色机(赛默飞,Gemini AS,英国),样本匀浆处理系统(耶拿,SPEEDMILL PLUS,德国),蛋白印迹系统(伯乐,Mini Trans-Blot,中国)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组实验干预

大鼠按体重随机分为3 组:正常组、模型组和中药组,每组各10 只。 参考课题组既往经验[14],正常组大鼠正常饲养,模型组于实验第1～ 21 天采用“力竭+控食”制备气虚血瘀证模型:于正式实验第1 天进行力竭游泳造模,以大鼠头不能露出水平面开始计时10 s 为力竭标准,频率为每天1 次;力竭游泳造模同时进行控食造模,每日摄食量为正常食量的1/2 的饲料,连续21 d。 于第22 天采用“冠状动脉左前降支结扎法”制备冠心病病理模型。 造模结束后,以第25 天上午8:00 为取材时间点。

1.2.2 益气活血方灌胃液的制备

取益气活血方加入处方剂量10 倍水,浸泡30 min 后,沸水文火慢煎2 次,每次40 min,合并2 次药液,过滤,浓缩至1.6 g/mL,4℃冰箱保存。

1.2.3 检测指标与检测方法

第25 天麻醉大鼠,取大鼠血清,脾组织、主动脉及缺血区心肌组织进行如下检测:(1)观察各组大鼠一般状态。 (2)ELISA 法检测大鼠血清中IL-37、IL-35 的水平。 (3)HE 染色法观察大鼠心、脾组织病理形态学改变;Masson 染色法观察主动脉病理形态学改变。 (4)免疫组化法观察大鼠心肌、主动脉、脾组织IL-37、IL-35 光密度表达。 (5)Western Blot法检测大鼠心、主动脉、脾组织IL-37、IL-35 蛋白含量的变化。

1.3 统计学分析

采用统计学软件SPSS 22.0 分析实验数据,根据不同的数据特点采用不同的检验法:计数资料采用χ2检验;计量资料以平均值±标准差(±s)表示,如果满足正态及方差齐性,采用成组t检验,不满足者采用秩和检验,P＜ 0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态比较

正常组大鼠精神状态良好,毛发润泽,反应灵敏;模型组精神萎靡、毛发粗糙无光泽,反应迟钝,消瘦;中药组毛发蓬松、稍有光泽,精神状态有所改善,体重略有增加,见图1。

图1 各组大鼠一般状态比较Note. A. Control group. B. Model group. C. Recipe group.Figure 1 Comparison of general state of rats in each group

2.2 各组大鼠血清中IL-37、IL-35 水平比较

与正常组比较,模型组大鼠IL-37、IL-35 显著降低(P＜ 0.00001);与模型组相比,中药组大鼠IL-37、IL-35 显著升高(P＜ 0.00001),见图2。

图2 酶联免疫吸附实验法检测结果Note. Compared between the two groups, ****P ＜ 0.00001.Figure 2 Test results of enzyme linked immunosorbent assay

2.3 各组大鼠心肌、主动脉、脾组织病理形态学比较

2.3.1 心肌组织HE 染色病理观察

正常组HE 染色可见心肌细胞整齐、致密、均匀排列,无核固缩甚至碎裂溶解。 模型组心肌细胞排列紊乱,心肌纤维走行较为紊乱,间质可见大量炎性细胞浸润。 中药组炎性浸润较模型组明显减少,可见组织纤维修复痕迹,见图3A。

2.3.2 主动脉Masson 染色病理观察

正常组动脉内膜平整,中膜平滑肌细胞排列致密整齐,无炎症细胞浸润,纤维清晰,无增生。 模型组外膜增厚、胶原纤维增生,中膜平滑肌细胞排列紊乱,局部有轻微增殖表现,内膜增生,结构紊乱并存在脂质沉淀。 中药组内膜变薄,纤维破损处可见修复痕迹,见图3B。

2.3.3 脾组织HE 染色病理观察

正常组大鼠红髓可见脾小梁(trabecula,T)为灰白色,呈条索状,红髓内可见大量分布的血窦(splenic sinus,SS),SS 外侧分布有较多的巨噬细胞。 脾中央动脉(central antery,CA)表面光滑形圆,周边分布大量的脾小体(splenic corpuscle,SCor),可见大量的B 细胞。 模型组见脾内结缔组织增生,T增厚,红髓区域变小,CA 增生。 白髓可见边缘区(marginal zone,MZ)和动脉周围淋巴鞘之间淋巴小结大量增多,提示抗原侵入脾内引起体液免疫应答。 中药组可见正常分布的T、SS,且CA 形态规则,见图3C。

图3 各组大鼠组织病理学Figure 3 Histopathology of rats in each group

2.4 各组大鼠心、主动脉、脾组织IL-35、IL-37 免疫组化染色比较

2.4.1 心肌组织免疫组化病理观察

与正常组相比,模型组大鼠IL-35、IL-37 均显著降低(P＜ 0.00001)。 与模型组相比,中药组大鼠IL-35、IL-37 均显著升高(P＜ 0.00001),见图4A,4B,4G,4H。

2.4.2 主动脉免疫组化病理观察

与正常组相比,模型组大鼠IL-35、IL-37 均显著降低(P＜ 0.00001)。 与模型组相比,中药组大鼠IL-35、IL-37 均显著升高(P＜ 0.00001),见图4C,4D,4I,4J。

2.4.3 脾组织免疫组化病理观察

与正常组相比,模型组大鼠IL-35、IL-37 均显著降低(P＜ 0.00001)。 与模型组相比,中药组大鼠IL35、IL37 均显著升高(P＜ 0.00001),见图4E,4F,4K,4M。

图4 各组大鼠心、主动脉、脾组织中IL-35、IL-37 的表达Note. Comparison between the two groups, ****P ＜ 0.00001.Figure 4 Expression of IL-35 and IL-37 in myocardium, aorta and spleen of rats in each group

2.5 各组大鼠心、主动脉、脾组织IL-35、IL-37 蛋白含量比较

在心、血管、脾组织中,与正常组比较,模型组大鼠IL-35、IL-37 均显著降低(P＜ 0.00001);与模型组相比,中药组大鼠IL-35、IL-37 均显著升高(P＜0.00001)。 见图5。

图5 各组大鼠心、主动脉、脾组织中IL-35、IL-37 的蛋白表达Note. Comparison between the two groups, **P ＜ 0.001.Figure 5 Protein expression of IL-35 and IL-37 in myocardium, aorta and spleen of rats in each group

3 讨论

沿用前期制备的“力竭+饥饿+结扎冠状动脉左前降支”造模方式复制CHD 气虚血瘀证模型。 造模后大鼠出现如精神萎靡、毛发粗糙无光泽、反应迟钝及消瘦等脾虚的一般状态变化。 这些表现与临床上脾虚患者倦怠乏力、形体消瘦和面色萎黄相似,与“劳倦”、“饮食过于饥饱”为损伤脾胃主要原因的观点相符。 本研究观察模型大鼠脾组织的病理改变,发现其脾内结缔组织增生,T 增厚、红髓区域变小,CA 增生以及MZ 淋巴小结大量增多,提示脾作为免疫器官,参与了CHD 免疫炎症反应。 本研究观察模型组大鼠主动脉病理改变,结果提示其主动脉外膜增厚、胶原纤维增生,中膜平滑肌细胞排列紊乱,局部有轻微增殖表现,内膜增生,结构紊乱并存在脂质沉淀。 继而,本研究观察模型组大鼠心肌组织病理改变,发现其心肌细胞排列紊乱,心肌纤维走行较为紊乱,间质可见大量炎性细胞浸润,上述改变可为脾与心两脏存在“母子相依、气血相济”的关系提供科学依据。 此外,还发现模型组血清中IL-35、IL-37 水平较正常组显著下降;模型组大鼠心、动脉、脾组织与正常组相比IL-35、IL-37 光密度值及蛋白水平显著降低,这可能与CHD 发生后,IL-35、IL-37 分泌被抑制有关。 因此,本研究得出结论,CHD 气虚血瘀证大鼠存在“心脾两虚”的病理改变,可为“心脾同治”理论提供模型支撑。

目前中药预处理成为心血管疾病防治领域的研究热点[15],课题组前期在造模第8 天起连续14 d运用益气活血方对模型进行预处理,发现益气活血方可改善CHD 气虚血瘀证模型大鼠心肌细胞损伤,记忆力减退、健忘及疲劳、反应迟钝的症状,并改善血液高凝状态[16]。 本研究结果显示以益气活血方干预后,大鼠毛发蓬松、稍有光泽,精神状态有所改善,体重略有增加。 提示益气活血方可改善脾虚的一般状态变化。 益气活血方干预后,心肌组织炎性浸润较模型组明显减少,可见组织纤维修复痕迹;主动脉内膜变薄,纤维破损处可见修复痕迹;脾组织可见正常分布的T、SS,且CA 形态规则。 提示益气活血方能减轻CHD 气虚血瘀证大鼠心脏、脾、血管靶器官的损害。 益气活血方干预后能上调血清中IL-35、IL-37 水平,且中药组大鼠心、动脉、脾组织与模型组相比IL-35、IL-37 光密度值及蛋白水平显著升高,提示益气活血方抑制组织炎症反应的分子机制可能与上调IL-35、IL-37 表达有关。

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