代谢性疾病病证结合动物模型的探讨与思考

任志鑫王雨张冰林志健巨珊珊

(北京中医药大学中药学院,北京 102488)

近年来,随着人民生活水平的提高,代谢性疾病的发病率呈上升趋势,严重威胁人类健康,包括糖 尿 病( diabetes mellitus, DM)、 高 脂 血 症(hyperlipoidemia)、 高 尿 酸 血 症(hyperuricemia,HUA)、痛 风(gout)、 肥 胖 症(obesity)、 高 血 压(hypertension,HTN)等。 中医药治疗代谢性疾病独具优势,以辨证论治为治疗特色,不仅可以从宏观角度对疾病的整体进行辨证论治,也可以从抑制炎症因子、调控信号通路、调节代谢相关因子等微观角度切入进行微观指标的考察[1],如代谢组学、蛋白组学等检测方法。 而病证结合的动物模型是中医药研究的基础,是沟通临床与基础研究的桥梁,体现出不同医学体系对疾病的不同认识角度[2]。代谢性疾病病证结合动物模型研究较多,但目前的研究对动物个体差异、证型演变及评价体系方面是否健全、有无统一的标准存在一定局限。 本研究系统地检索糖尿病、高血压、高脂血症、肥胖症、高尿酸血症及痛风的病证结合动物模型,从动物品系、性别、造模方式、指标评价体系等方面整理、归纳、分析、总结病证结合动物模型的特点,为中药防治代谢性疾病建立合理的、可靠的病证结合动物模型奠定基础。

1 方法

1.1 数据来源

本研究在中国期刊全文数据库(CNKI)、中国学术期刊数据库(万方)、中国科技期刊数据库(VIP)及PubMed 数据库,对1990 ～ 2021 年有关糖尿病、肥胖症、高脂血症、高尿酸血症与痛风、高血压的所有文献进行专业检索。 检索字段定为篇关摘AND 主题NOT 篇名的检索形式。 篇关摘即是在篇名、关键词、摘要范围内进行检索,该检索方式相较主题词检索较精确,但对于精确检索篇名、关键词及摘要内容更为丰富,适合本文进行深入研究。 检索式以篇关摘检索:疾病AND 证候AND“中医证候”+“病证结合”+“证候”+“证型”+“型”+“辨证分型”AND 主题检索:动物模型NOT 临床研究为基本格式确定各代谢性疾病的检索策略(如表1),共检索到糖尿病297 篇,肥胖症6 篇,高脂血症22 篇,高尿酸血症及痛风17 篇,高血压150 篇。 发现相关英文文献极少有证候模型的相关研究,筛选后没有符合条件的论文,故文中没有纳入。

表1 各代谢性疾病病证结合动物模型的检索式Table 1 Retrieval formula of various metabolic disease syndromes combined with animal models

1.2 数据处理

将所查找到的数据导入Note Express 软件中,去除重复,并排除不相关文献,排除标准如下:(1)剔除综述、会议集、报纸等的文献;(2)剔除不涉及造模方法的文献;(3)剔除临床试验研究的文献。流程如图1 所示。

图1 文献筛选结果Figure 1 Document screening result

2 结果

2.1 代谢性疾病相关的病证结合动物模型年发文量统计

为整体把握代谢性疾病的病证结合动物模型的年度数量变化,对检索到的243 篇文献统计分析,其中以糖尿病占比最高(54%),肥胖症占比最少(1%)(如图2)。 病证结合的动物模型数量的疾病由高到低依次为:糖尿病＞高血压＞高脂血症＞高尿酸血症及痛风＞肥胖症(如图3)。

图2 各代谢性疾病病证结合动物模型占比分布Figure 2 Percentage distribution of animal model combining disease and syndrome related to metabolic diseases

图3 1990 ～ 2021 年代谢性疾病相关的病证结合动物模型年发文量统计Figure 3 Animal model combining disease and syndrome related to metabolic diseases in 1990 ～ 2021 annual number of documents issued statistic

2.2 代谢性疾病相关的病证结合动物模型情况分析

病证结合动物模型是将西医的病与中医的证结合诱导出的动物模型,既有中医整体观的优势,又有西医病理生理的特点,故本研究针对代谢性疾病相关病证结合动物模型的动物品系、造模方式、指标评价等展开如下分析:

2.2.1 糖尿病相关的病证结合动物模型

临床上Ⅱ型糖尿病早期为热盛伤津、肝郁脾虚、痰浊中阻、湿热蕴结型;中期为肺肾阴虚、脾气亏虚、脾肾气虚型;晚期为肝肾阴虚、阴阳两虚型[3],已有的病证结合动物模型主要有:气阴两虚型、内热偏盛型、湿热困脾型和阴虚内热型的模型(表2),并针对该疾病模型发现在一个疾病的不同阶段表现不同的证候,符合临床糖尿病早、中、晚期分型。

表2 糖尿病相关病证结合动物模型的现状Table 2 Current status of animal models for the combination of diabetes-related pathologies

目前糖尿病病证结合动物模型多采用疾病因素与证候因素相叠加造模, 链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)对动物的胰岛β 细胞有选择性的破坏作用,饲喂高脂高糖饲料是从病理、生理角度接近人类糖尿病的动物模型。 采用多次小剂量注射STZ 可降低动物死亡率,观察到其疾病0 ～ 3 周出现内热偏盛型,3 周后兼有阳虚证、气虚证,10 周表现出阴阳两虚证,该模型提示证候存在经时自然演变过程,为中医证候模型研究提供一种思路,也为中医辨证用药研究提供一种证候模型,但造模周期长。 联合其他造模因素可缩短其成模时间,如:多次小剂量STZ 注射4 周,加食高糖高脂饲料至14 周较好地反映了Ⅱ型糖尿病气阴两虚证模型的研究[4],该模型简单、可操作;连续9 d 注射STZ,同时灌胃温热药物,分别在14 d 出现阴虚热盛症状,35 d 出现气阴两虚症状;高脂高糖饮食、注射STZ 结合耗气伤阴中药水煎剂4 周,可制备气阴两虚证糖尿病[5],以益气补阴方反证,具有明显的改善作用,该模型可缩短单纯高脂高糖饮食制备周期长的问题;高脂饲料联合小剂量注射3 周STZ 基础上,注射1 周拮抗胰岛素的激素药物,增加体内各组织代谢活性,制备了内分泌性糖尿病动物模型,该模型模拟了阴虚内热型的证候,造模周期短、成本低、动物死亡率低。 采用自发性糖尿病小鼠,KK-Ay小鼠模型从发病(12 周)～20 周是气阴两虚证的最佳周期,基因缺陷型动物模型在代谢途径中建立生物模型具有稳定性,如db 小鼠是自发性Ⅱ型糖尿病模型,其生理与行为特征与人类Ⅱ型糖尿病的表现极为相似,但是成本较高,应用方面受到了一定限制。 传统方式摘除单肾与“行为学”干预建立的糖尿病肾病病证结合动物模型[6],成本低、耗时短,但操作复杂,证候因素与疾病因素相叠加也增加了模型的不稳定性。 目前已有的病证结合模型多是通过物理、化学、手术等因素诱导下模拟,与机体自身或某种疾病状态下的自然演变差异大。 而中医药强调整体观,不同时期存在不同的证候。 单一指标难以体现证候的动态性,运用现代科技手段,将微观与宏观指标相结合,体现“病-证”结合的特点,通过采用方药的多靶点、多效应的反证优势综合判定证候的动态性[7]。

2.2.2 肥胖症相关的病证结合动物模型

临床上肥胖症证型分为脾虚湿阻、脾肾两虚、肝郁气滞、阴虚内热、胃热湿阻型五大类[13]。 目前肥胖症的造模方式主要模拟临床发病病因,采用饮食联合环境因素造模,观察到模型动物中医证候为临床最常见的脾虚湿阻型(表3)。

表3 肥胖症相关病证结合动物模型的现状Table 3 Current status of animal models for the combination of obesity-related pathologies

采用“饮食因素”、“高脂饮食+湿邪因素”等营养性肥胖的造模方式,通过改变摄入量,影响其内分泌。 研究发现单纯性肥胖模型复制成功的基础上出现脾虚湿阻证,该模型模拟临床脾虚湿阻型单纯性肥胖,而胰岛素抵抗或去卵巢大鼠模型或引起代谢紊乱的复合肥胖模型也有相应的研究,如林志健[14]采用高嘌呤食饵建立高尿酸血症合并腹型肥胖病证结合鹌鹑模型,“四诊”合参分析该模型具有“脾虚痰湿”证型。

针对疾病模型的选择方面,不仅可以采用饮食因素诱导,也可对目前较为主流的瘦素缺陷型肥胖小鼠等基因缺陷型模型展开研究,对已有的脾虚湿阻型单纯性肥胖应开展进一步药理药效、病理机制等研究,为临床助力,而对单纯性肥胖所表现的其他证候尚未涉足,应结合中医理论建立证候模型,并将四诊信息应尽量实现定量分析,对精神状态、毛色、运动能力等指标也可采用量表的方法进行量化分析[15]。

2.2.3 高脂血症相关的病证结合动物模型

高脂血症是指血脂异常升高,证型包括痰浊内阻、脾虚湿盛、气滞血瘀、肝肾阴虚型[18]。 目前高脂血症相关的病证结合动物模型主要为痰浊阻滞、气滞血瘀、气郁血瘀型(表4),符合中医理论中膏脂粘滞致气血运行阻滞,引起脂浊,是高脂血症的始动因素。

表4 高脂血症相关病证结合动物模型的现状Table 4 Current status of combined animal models of hyperlipidemia-related pathologies

高脂饲料引起大鼠自身调节胆固醇能力变差,诱发痰浊阻滞型高脂血症。 分析现有模型,过食高脂饮食4 周,并通过化浊调脂方给药4 周观察对大鼠的血脂代谢及外观体征的改善,可判定痰浊阻滞证型,该模型适用于临床上饮食不节、过食肥甘饮食导致痰浊内生。 灌胃脂肪乳剂摄入量均一,8 周可有效引起大鼠脂代谢紊乱,同时灌胃第3 周尾静脉一次性注射小牛血清蛋白,结合连续冰水浴5 周的方式能引起气滞血瘀的症状。 该造模方法成模均匀、模拟了临床气滞血瘀证的病因病机,但周期长、操作繁琐且工作量大。 结合行为学干预(如使其处在激怒、争斗状态),与临床情志失调,导致脾虚气结;夹尾实验结合饮食造模8 周可出现与临床气郁血瘀证候相似的模型;电、光等应急刺激后大鼠的外观体征与临床气滞血瘀证的表征相似,可持续6 周,第9 周给予药物治疗可明显改善表征,但周期长、操作繁琐,且长期处于不间断的刺激环境,增加了紧张、焦虑的情绪,影响正常进食及活动。 目前研究发现ApoE-/-转基因小鼠,在高脂高胆固醇饮食下,加速高脂血症的发生,可节约造模时间。

通过以脂代谢相关指标既可以确定疾病模型的建立,同时也对痰浊证候有一定的阐释作用,将与疾病相关的生化指标纳入证候的诊断指标,强调了中医“病-证”整体观的概念,通过采用不同的理化指标组合变化模式来更好的体现证候的属性特点[19]。

2.2.4 高尿酸血症与痛风相关的病证结合动物模型

《中医病证诊断疗效标准》将痛风的证候分为:湿热蕴结、瘀热阻滞、痰浊阻滞、肝肾阴虚型[24]。 目前的高尿酸血症病证结合动物模型有脾虚痰湿、瘀血型,痛风病病证结合动物模型为湿热蕴结型(见表5)。

表5 高尿酸血症与痛风相关病证结合动物模型的现状Table 5 Current status of combined animal models of hyperuricemia and gout-related pathologies

张冰等[25]等观察到高尿酸血症鹌鹑的行为学表现及舌质变化,发现其病理改变与中医理论认识有相似之处。 分析现有模型,高嘌呤饮食增加尿酸前体物质生成,引起高尿酸血症,选择与人类尿酸代谢途径相似的鹌鹑为实验动物,高果糖造模28 d后出现与临床“脾虚痰湿”证相似的症状,选取健脾利湿的中药菊苣以药反证,对该模型的证候进一步验证;腺嘌呤导致肾脏损伤,阻碍尿酸排泄,引起高尿酸血症,发现血府逐瘀汤改善作用最显著,推断血瘀可能是该模型的证候特点。 采用连续高脂高糖饮食15 d、湿热环境下5 d 的复合干预因素建立符合痹症湿热蕴结型的诊断标准的证候模型,在证候模型上踝关节注射尿酸钠(monosodium,MSU),该方法虽然处于高尿酸血症状态下,且简单、成模率高,但其外源性注射MSU 容易引起特异质炎症反应,模型容易消退。 没有在本质上模拟临床人类发病特征,忽略了痛风具有进展性、全过程的性质。

目前逐渐认识到高尿酸血症和痛风是一个疾病的不同阶段,而从整体认识高尿酸血症和痛风的病证结合动物模型亟待建立,以中医角度进一步阐释高尿酸血症和痛风之间的关系。 优化指标体系,如“热”的生理机制与血浆内皮素和降钙素基因相关肽的反馈调节密切相关[26];对于脾虚型痛风,D-木糖可作为脾虚证实验室指标可作为诊断证候的重要指标[27],但不能完全代表临床表征,研究证的本质还应结合动物的表征,寻找四诊量化的新方法。

2.2.5 高血压相关的病证结合动物模型

高血压属于中医“眩晕”、“头痛”的范畴,临床上高血压的辨证分型包括气血亏虚、阴虚阳亢、肝火亢盛、气虚血瘀、痰湿壅盛、混合型[32]。 目前病证结合动物模型有阴虚阳亢、肝火亢盛、肝阳上亢型兼瘀血证、痰湿壅盛、肝亢痰滞型(见表6),根据不同的造模方式所表现不同的证候与临床不同发病病因的高血压所表现的证候相一致,造模因素全面,贴近临床研究。

表6 高血压相关病证结合动物模型的现状Table 6 Current status of combined animal models for hypertension-related pathologies

自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)应用最广,是研究高血压发病机制和筛选降压药物的理想动物模型,该模型14 ～ 18 周龄以阳亢为主要证候[33],该模型适用于对原发性高血压发病机制的探讨。 通过对该疾病模型物理、化学、手术等因素造模导致不同的证候出现,如:对SHR大鼠灌胃附子汤及高脂饲料连续8 周后,表现出肝阳上亢及痰湿证;电刺激对SHR 大鼠三叉神经节引起的偏头痛与瘀血型临床表征相似,造模时间短,开颅时导致的出血符合外伤瘀血模型;以颈内动脉两次注入月桂酸钠损伤SHR 大鼠脑内微小动脉血管内皮的方式,联合长期激怒法模拟临床阴虚阳亢、瘀血阻络的发病特点及病理改变,但手术过程复杂、难度较高、动物价格昂贵且饲养要求高。 满足以病统证的情况下多种证型的研究,考虑造模因素全面,贴近临床研究。 灌胃附子汤是模拟临床肝阳上亢型高血压动物模型的方式,简单、经济,持续4 周可引起肝阳上亢症状,具有病理生理相结合的病证结合模型优势,其机制可能与降低血浆AngⅡ水平有关。 局部注射聚桂醇注射液联合灌胃附子汤3 周,可制造大鼠颈性眩晕的肝阳上亢模型[34];夹闭大鼠左肾动脉2 周加灌胃附子汤4 周可诱导出肝阳上亢证高血压病,与临床肝阳上亢证的症状相一致[35],但其在手术过程中存在操作复杂、极易导致动物死亡等问题,并且其形成的高血压主要是肾血管性高血压,与人类高血压发病情况不相符合。 高脂高糖饮食法操作简单、安全性高,模型表现出的症状符合临床痰湿壅盛型的症状,证候成模率高,但病证结合的成模率较低,停止喂食后可自行恢复,且造模时间长(分别为16、25 周[36])。

高血压动物模型包括遗传、手术干预或药物诱导等方式,其具备高血压临床特征,实质发病过程与人类自发高血压病程有一定的差距,而饮食诱导的成模率低,因此,将各因素结合造模,寻找一种稳定可靠的高血压病证结合动物模型亟待解决。 在不同证候下指标存在复杂的关系,应对实验室指标与证候指标进行相关性分析,为探讨中医药治疗高血压的作用机理奠定基础。

3 总结

病证结合模型在很大程度上弥补了中医药在动物模型上研究的空白,目前病证结合动物模型大多为疾病模型联合证候模型,导致出现单个疾病对应单个证候的现象,且造模大多采用行为学刺激,而临床上一个疾病相兼多个证候、涉及多个脏器,以及在不同的时期表现出不同的证候,具有进展性。 所以构建病证结合的动物模型应根据疾病的发病特征,通过饮食、环境等因素综合考虑构建具有进展性特点的模型,且因遵循伦理原则,避免或减少动物的应激、痛苦和伤害,采取痛苦最小的方法处置动物,有助于为临床治疗提供可靠的参考价值。

中医证候的研究向实验室转变,指标由宏观、定性逐渐向微观、定量转变。 现有的模型采用创伤性的手段检测生化、免疫、酶学等实验室指标,导致无法动态跟踪疾病的全程证候。 如关节炎类动物关节液获取困难,采用“实时、动态、微创”的微透析仪器辅助,可实现对疾病进行全程观察。 体现指标的客观化,如钱宏梁等[42]将红外热像技术运用于观察小鼠阳盛阳衰的证候中,方肇勤等[43]为大鼠小鼠创建中医诊法和辨证方法,其中通过使用影像设备,拍摄受试动物的舌、爪、尾的颜色,并使用Photoshop 对图像进行定性定量分析。 协同宏观表征与微观指标发挥判定作用,而非证候的特异性和病理指标的特异性。 注重多学科交叉融合,如王恒和等[44]提出“证治代谢组学”的假说,中医证候在辨证论治前后患者体内存在代谢物的特异性差异,由此为深入研究辨证论治创造条件。

综上所述,病证结合动物模型仍处于不断探索和发展的阶段,动物模型应贴近临床,通过对模型的干预因素、指标评价体系的不断探索、挖掘和解释,推动病证结合动物模型的不断发展,促进辨证论治的基础研究与发展,为中医药防治代谢性疾病的研究奠定基础。

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