模式物种斑马鱼在我国传统饮用酒类功效成分研究中的应用前景

2022-03-02王司航蔚慧欣张左兵

中国酿造 2022年11期

杨波，王司航，张鑫，蔚慧欣，刘娜，张左兵，3，4*

（1.山西杏花村竹叶青产业有限责任公司中国露酒植物提取与健康山西省重点实验室，山西吕梁 032205；2.山西大学生命科学学院，山西太原 030006；3.山西大学化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西太原 030006；4.山西大学杏花村学院（山西酿造产业研究院（筹）），山西太原 030006）

我国白酒、黄酒、露酒等传统饮用酒类自古以来备受广大人民的喜爱，尤其是在各种仪式、节日、社交聚会、商业场合和特殊活动中。在长期的饮酒实践过程中，人们发现过度饮用会造成多种健康问题。21世纪初，我国部分省份流行病学调查发现：酒精性肝脏疾病在饮酒人群中平均发病率在0.50%～8.55%之间，其中，在40～49岁人群中高达11.6%[1]。随着经济的发展，人们在利用酒作为媒介进行情感交流的同时，健康饮酒的意识也日益增强。目前，利用动物模型进行的饮酒健康相关研究大多都是以单一的乙醇为材料展开的[8-12]。然而，我国传统饮用酒类成分复杂，乙醇虽是主要成分，但不是唯一成分[2]。因此，只通过研究乙醇对健康的影响而评价饮酒健康问题是不客观全面的。以白酒为例，水和乙醇虽然占98%～99%，但占比仅为1～2%的微量成分十分复杂，对酒质的影响巨大，主要包括酯类、杂醇类、有机酸、醛类等[2]。这些微量成分之间可通过复杂的化学反应进一步生成更复杂的结构，从而影响陈酿过程、酒的风味等[3]。这些微量成分及其衍生物对健康是否造成影响值得关注。露酒的成分则更为复杂，以竹叶青为例，配制的草本有12种，王志娟等[4]采用顶空固相微萃取-气质联用（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技术从竹叶青中检测到65种挥发性化合物，其中30余种来自配制用的药材。这些成分中既有对人体有益的功能活性成分，如D-柠檬烯、莰烯、β-蒎烯、丁香酚、乙酸龙脑酯、α-檀香醇等；也有一些功能尚未确定的物质，如1-甲基-4-（1-异丙基）-1,4-环己二烯、3,4-二甲基-3-环己烯-1-甲醛和二去氢菖蒲烯等[5]。自“中国白酒3C计划”[6]和“中国白酒169计划”[7]启动以来，白酒中有益健康的成分虽然不断被报道，但对这些物质的功效研究还很不足，特别是对白酒等传统饮用酒类衍生出的露酒的研究非常不足，关于保健成分功效分析的报道有待于加强。

1 酒类功效研究模型动物

尽管体外（in vitro）细胞模型在很多化合物的功能研究中发挥了重要的作用，但是考虑到机体的复杂性，体外研究并不能完全反映体内情况，因此，体内（in vivo）模型在化合物的功能研究中仍然不可或缺。由于伦理原因，酒类有效成分的体内研究多是利用人以外的其他物种来进行的[8]。其中，啮齿类应用最为广泛，Lieber-DeCarli模型和Tsukamoto-French模型是常见的模型[9]。但这类模型存在着明显的不足[10]：利用Lieber-DeCarli模型的酒精慢性暴露实验中，即便在饮水中添加酒精长达9个月，也只能让小鼠肝脏产生脂肪变性，而不会产生纤维化变化。因为在这个模型中，小鼠血液的乙醇浓度不足以诱发脂肪变性以外的肝损伤[11]。此外，在饮用水中添加酒精，有些小鼠会产生拒饮情况，导致造模失败。在Tsukamoto-French模型中，小鼠被植入胃管，通过灌胃虽可使血液中乙醇浓度增加，但如果没有其他因子（如日粮变化，添加化学制剂）的协同作用，产生更严重的肝脏疾病，如肝脏纤维变性和肝硬化的概率也依然较小。而且这种模型需要特定的设备、熟练的技术及相对较高的成本[8]，因此，广泛应用于酒类功效研究的难度较大。

近年来，新兴模式物种斑马鱼逐渐被引入酒精研究中[11-17]。目前，斑马鱼被美国国立卫生研究院（national institutes of health，NIH）列为继小鼠后第二优先资助的脊椎动物。国际基因组参考联盟（genome reference consortium，GRC）更是将斑马鱼基因组后续完善工作列为人类、小鼠基因组之后的重点工作。以斑马鱼为实验动物，酒精可以直接添加到养殖水中，克服了啮齿类模型中拒饮的不足，并且可以通过取特定组织进行研磨，使用相应的试剂盒、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）或气相色谱（gas chromatography，GC）的方法分析斑马鱼对有效成分的吸收与代谢情况。因此，斑马鱼是一种不可多得的酒类功效研究理想模型。目前，斑马鱼已经被用于乙醇暴露后的代谢、肝脏疾病和神经、行为等研究中[12，15，17-18]，本实验室也建立了斑马鱼暴露于竹叶青酒的暴露模型。

2 斑马鱼具有较为保守的酒精代谢通路

对于哺乳动物而言，进入其机体的酒精约10%通过呼吸、汗液和尿液排出体外，约90%的酒精则通过氧化而被消耗，氧化反应主要发生在肝脏细胞中[19]。位于细胞质内的乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）将酒精代谢为乙醛，乙醛在线粒体内被乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）代谢为乙酸，进而以乙酸盐的形式排出体外[20]。细胞色素P450家族2亚族E成员1（cytochrome P450 family 2 subfamily E member 1，CYP2E1）也可将乙醇氧化为乙醛，尤其是在酒精过量时的乙醇代谢中起着重要作用[19-20]。当体内酒精浓度低时，乙醇的代谢主要依赖于ADH，但由于此酶是本底表达，极易达到饱和，因此当乙醇浓度高，特别是长期过程中，微粒体内的CYP2E1就是重要的乙醇代谢酶，能够被诱导表达到正常水平的10～20倍[19]。在斑马鱼中，已先后发现了编码ADH的直系同源基因adh5a[21]、adh8a和adh8b[22]。ADH1抑制剂4-甲基吡唑（4-methylpyrazole，4-MP）可增加斑马鱼胚胎对乙醇的耐受[18]。虽然在斑马鱼中没有找到cyp2e1同源基因，但是斑马鱼含有41个cyp2基因，其中cyp2y3和cyp2p6与人的cyp2e1最为接近，蛋白水平相似性达43%[18，23]。研究还发现，1%乙醇处理斑马鱼18 d后，肝脏cyp2y3的信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）水平上调9倍，且CYP2E1抑制剂氯美噻唑（chlormethiazole，CMZ）可显著增强斑马鱼的耐受，提示斑马鱼存在类似CYP2E1的乙醇代谢路径[18，24]。斑马鱼基因组测序完成后，研究人员发现斑马鱼中存在大量aldh家族基因[25]。在哺乳动物代谢乙醛过程中起重要作用的aldh1和aldh2基因的同源基因，在斑马鱼中分别存在4个（aldh1a2、aldh1a3、aldh1l1和aldh1l2）和3个同源基因[25]。ALDH2抑制剂氰胺（cyanamide，CYA）可降低斑马鱼幼鱼对乙醇的耐受[18]，提示ALDH在斑马鱼的乙醛代谢中也发挥着重要作用。由此可见，在斑马鱼中存在与哺乳动物相同或相似的乙醇代谢通路，这是利用斑马鱼作为模型研究酒类功效的基础。

3 斑马鱼特别适用于高通量筛选和分子机制解析

除了上述优越条件外，斑马鱼具有体积小、饲养成本低、基因组已知且易于编辑、世代间隔时间短、单次产卵量大、易于获得胚胎以及早期发育过程中具有光学透明性、存在突变的透明品系等诸多优点，便于开展深入研究[18]。斑马鱼胚胎和幼鱼尤其适用于基于表型的大规模小分子筛选，因为斑马鱼可以有效吸收周围水环境中的复合物等小分子，可将它们放于96孔板，直接吸收小分子，配合近年来发展起来的人工智能新技术，使复杂的大规模的筛选过程变得简单易行[26-27]。此外，斑马鱼的基因操作技术日臻完善，基于Tol2转座系统的转基因技术结合荧光标记技术，已经广泛用于斑马鱼转基因品系的建立[28]。斑马鱼胚胎透明且存在成体透明品系的特征，使得其十分适用于活体标记细胞和分子的实时研究[29]。一旦明确了酒类中功效物质的靶分子，可望构建荧光标记的转基因品系并建立快速筛选模型，开展大规模的筛选工作[30]，这在啮齿类等动物模型中很难做到。近年来基于规律间隔成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）系统的基因定点突变、敲除和敲入技术也被广泛应用于斑马鱼[31-32]。通过对候选靶基因的编辑，可进一步深入探讨酒类功效分子的作用机制。由此可见，斑马鱼胚胎及成体既可以进行大规模的功效分子筛选，还可以深入进行功效分子的作用机理研究。

4 斑马鱼用于酒精性肝脏损伤的研究

肝脏是机体代谢酒精的主要场所，摄入过量酒精常会造成酒精性肝脏疾病的发生，如酒精性脂肪肝、肝炎、肝硬化甚至肝癌[33]。重度酗酒者中，60%～100%的人在初期会发生肝脏脂肪变性，其中10%～35%的人会继发不同程度的纤维化，10%～15%的人还会发生肝硬化，1%～2%的人甚至会进一步发展成肝癌[34-35]。在我国，酒精已经成为继病毒性肝炎后，引起肝脏损伤的第二大病因[1]。因此，酒精性肝脏疾病已成为医学研究的重要内容。

斑马鱼肝脏拥有在哺乳动物肝脏中已发现的主要细胞类型，而且在肝脏基因突变后，表现出与哺乳动物类似的病理特征[36]，经环境污染物刺激后，病理特征与哺乳动物也类似[36]。目前，斑马鱼已经被用于研究包括酒精性肝脏疾病在内的多种肝脏疾病[36-37]。孵化4 d的斑马鱼幼鱼，暴露于体积分数2%的乙醇24 h后，即可引起肝脏异常肿大、脂肪变性和纤维化[38]。斑马鱼成鱼暴露于体积分数1%乙醇中3个月，在第一个月，斑马鱼的肝脏出现脂滴聚集，肝脏气球样变性、酒精性透明小体，显示出肝脏脂肪变性和脂肪性肝炎病变；随着暴露时间的增加，肝脏逐渐出现纤维化，如肝脏细胞外基质中胶原沉积、肝细胞出现多形性细胞核，并形成小结等[11]。斑马鱼成鱼暴露于体积分数0.5%乙醇4周，会造成肝脏脂肪变性，粗面内质网脊和糖原颗粒数量增加、脂滴及脂质颗粒，调节脂质代谢的去乙酰化酶1（sirtuin 1，Sirt-1）和肝脏促炎性因子白细胞介素1β（interleukin 1 beta，IL1β）表达显著增加，抗炎的脂联素（adiponectin）分子及其受体脂联素受体2（adiponectin receptor 2，Adipor2）表达也显著增加[12]，表现出酒精性肝脏疾病相似的病理特征[12，36-37]，因此，斑马鱼是一种不可多得的研究酒类对肝脏影响的模式动物。

5 斑马鱼用于酒精引起焦虑的研究

酒精对人类焦虑的影响机制一直是研究人员关注的重点之一。饮用低浓度的酒精会使人愉悦、放松，起到缓解压力或焦虑的作用，但长期饮用则会形成对酒精的依赖，一旦戒酒时，会增加压力和焦虑[39]。由于压力、焦虑与酒精依赖之间关系复杂，潜在的分子和细胞机制到目前为止尚未明了[40]。近年来，作为一种适合进行高通量筛选的脊椎动物模型生物，斑马鱼行为分析已被用于研究学习、记忆、恐惧和焦虑以及社会行为等方面[41]。多个斑马鱼行为评价模型被用于分析酒精对动物焦虑行为影响的研究，如新型鱼缸潜水测试（novel tank diving test）和光/暗选择试验（light/dark choice assay）[41]。利用这两个模型，研究人员发现急性乙醇暴露可产生显著的剂量依赖性焦虑作用，慢性间歇性乙醇暴露戒断后，焦虑症不能康复，这与人类饮酒实际情况较为一致[15]。现代分析技术可以解析饮用酒类的化学成分，利用斑马鱼行为分析模型的便捷性和直观性，可以进行高通量的筛选，从而分析目标成分的功效。此外，还可以用于酒类新工艺、新产品特性的检验等试验。