高效液相色谱法测定乳酸菌发酵液中γ-氨基丁酸

刘宗乐，高林森，张东东，韩俊华，赵娟娟，高文惠*

（1.河北科技大学 食品与生物学院，河北 石家庄 050018；2.河北省农林科学院农业信息与经济研究所，河北 石家庄 050050；3.河北省果蔬发酵技术创新中心（筹）（SG2021129），河北 衡水 053000）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种非蛋白氨基酸。目前，GABA作为重要的抑制性神经递质，在生理活性、作用机制以及制备方法等方面已经有了较为深入的研究。研究发现，通过γ-氨基丁酸A型受体（γ-aminobutyric acidAreceptor，GABAAR）、γ-氨基丁酸B型受体（γ-aminobutyric acid B receptor，GABABR）和γ-氨基丁酸C型受体（γaminobutyric acid C receptor，GABACR）这三种受体，GABA可以起到调节情绪[1]、改善睡眠质量[2]和增强记忆力[3]等作用。此外，GABA在癫痫[4-5]、降血压[6]、糖尿病[7]以及一些神经系统疾病[8]中发挥着有益作用。微生物发酵法是制备GABA的主要方法之一，该方法具有得率高、安全性好以及条件温和等优点[9]，其合成机制是利用乳酸菌、酵母菌、霉菌等微生物体内谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸脱羧形成GABA[10]。短乳杆菌与希氏乳杆菌发酵制备的GABA已被批准为新资源食品，在食品工业中有着良好的应用前景，建立适用于发酵液中定量分析GABA的检测方法对评价乳酸菌发酵产品质量具有参考意义。

目前，针对国内外关于GABA的检测方法主要有高效液相色谱法、纸层析-酶标仪法、毛细管电泳法等。农业部标准NY/T2890—2016《稻米中γ-氨基丁酸的测定高效液相色谱法》[11]，以4-二甲基胺基偶氮苯-4-磺酰氯作为衍生化试剂，但样品前处理较复杂且耗时长。郭海洋等[12]采用超高效液相色谱法对乳酸菌发酵液中GABA含量进行测定，目标物保留时间较长。张敏等[13]采用纸层析-酶标仪法测定了微孔板发酵液中GABA产量，HAGI T等[14]采用毛细管电泳法对乳酸菌发酵乳中GABA含量进行了测定，但纸层析-酶标仪法和毛细管电泳法精密度相对较低。为此需开发简单、快速、精密准确的检测发酵液中GABA方法。与多数氨基酸一样，GABA需要通过衍生化处理来实现对目标物质的定量测定，邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）[15-16]、丹磺酰氯[17-18]、2,4-二硝基氟苯[19-20]和异硫氰酸苯酯[21]等是常用的衍生剂。其中，OPA相比后3种衍生试剂具有操作简便，反应快速，且本身不具有紫外吸收等优点。

本试验拟采用OPA作为柱前衍生化试剂，通过单因素试验，研究衍生试剂浓度、衍生时间和衍生温度的影响，优化并选择检测波长、流动相比例和柱温条件，建立一种简单、灵敏、精密准确，适用于乳酸菌发酵液中GABA的定量分析方法，为筛选高产GABA乳酸菌菌株提供理论依据，同时为开发高效GABA发酵工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

分离自桑葚、蓝莓中的5株乳酸菌，经生理生化特征及16S rDNA序列测序鉴定，均为植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum），本实验室保存菌种。

1.1.2 化学试剂

GABA标准品（纯度≥99%）：上海源叶生物科技有限公司；OPA、β-巯基乙醇（纯度99%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈（色谱纯）：天津赛孚瑞科技有限公司；氢氧化钠、结晶乙酸钠、冰乙酸、硼酸（均为分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；L-谷氨酸钠（分析纯）：山东西亚化学股份有限公司；实验室用水为超纯水。

1.1.3 培养基

MRS液体培养基：蒸馏水1.0 L，蛋白胨10.0 g，葡萄糖10.0 g，结晶乙酸钠5.0 g，牛肉浸粉5.0 g，酵母浸粉4.0 g，柠檬酸胺2.0 g，吐温-80 1.0 mL，磷酸氢二钾2.0 g，MnSO4·H2O 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，pH值调至6.8，121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基：在上述MRS液体培养基中添加质量分数为1%的L-谷氨酸钠，pH值调至6.8，121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260高效液相色谱仪：安捷伦科技（中国）有限公司；UPT-I-10T超纯水制备机：四川优普超纯科技有限公司；TGL-16C高速离心机：上海安亭科学仪器厂；ST3100实验室pH计：奥豪斯仪器有限公司；KH5200超声波清洗仪：昆山禾创超声仪器有限公司；SHB-3A循环水式多用真空泵：郑州杜甫仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌发酵液制备

分别将5株乳酸菌在无菌环境下接种于MRS液体培养基中，37 ℃培养12 h，转接3次至菌株活力恢复至正常生长状态，得到种子液。种子液以4%接种量接入发酵培养基中，37 ℃静置培养48 h，得到5株乳酸菌发酵液，编号为样品1#～5#。分别取适量样品1#～5#，10 000 r/min离心10 min，将所得上清液过0.22 μm有机滤膜，待检测使用。

1.3.2 溶液的配制

GABA标准溶液的配制：准确称取10.0 mg GABA标准品用水溶于10mL容量瓶中，定容，得到质量浓度为1.00mg/mL的母液，并依次稀释为0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、3 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、250 μg/mL、400 μg/mL和500 μg/mL的系列标准溶液，置于0～4 ℃保存备用。

硼酸缓冲液的配制：称取2.47 g硼酸溶于85 mL水中，用氢氧化钠调pH=10.4，定容至100 mL，置于0～4 ℃可保存7 d。

OPA衍生液的配制：准确称取5.0 mg OPA，超声溶解于2.5 mL乙腈中，再加入β-巯基乙醇10 μL，置于0～4 ℃避光，可保存7 d。

1.3.3 衍生条件的优化

由于GABA本身无紫外吸收，故标准溶液和样品溶液中的GABA需要进行衍生化处理，进而实现定量测定目标物质的目的。本试验采用OPA作为柱前衍生化试剂，使OPA与GABA在pH=10.4的硼酸缓冲液反应体系下发生衍生化反应，生成具有紫外吸收的物质，但该生成物的稳定性差。因此，试验对不同衍生试剂浓度（5～30 mmol/L）、不同衍生时间（1～7 min）和不同衍生温度（室温～65 ℃）的影响进行了考察。

操作流程：用移液枪分别量取1.3.2配制的硼酸缓冲液400 μL、OPA衍生液80 μL以及GABA标准溶液或样品溶液80 μL，混合，即衍生反应开始，过0.22 μm有机滤膜，洗针，量取20 μL，立即进样分析检测，并严格控制整个衍生操作时间。

1.3.4 色谱条件的优化

在上述最佳衍生条件下对GABA标准溶液进行衍生化处理，采用二极管阵列检测器在210～400 nm范围内对衍生物进行光谱扫描，根据紫外吸收和实际分离情况选择最适检测波长。并在该检测波长下，考察不同流动相比例（乙腈与20 mmol/L结晶乙酸钠体积比分别为23∶77、22∶78、21∶79、20∶80）、不同柱温（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）对分离效果的影响，以确定最佳流动相比例和柱温条件。其他色谱条件为：XBridgeC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速0.8 mL/min；进样量20 μL。

1.3.5 数据处理

通过Agilent 1260高效液相色谱仪配套的Chem Station工作站完成数据的采集与处理。采用Excel 2016和Origin 2019b进行数据处理和绘图。每组试验重复测量3次，数据均为3次平行试验平均值。

2 结果与分析

2.1 衍生试剂浓度的影响

选取同一质量浓度的GABA标准溶液，分别采用浓度为5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L的OPA衍生剂进行衍生化处理后快速进样分析检测，以考察衍生试剂浓度对峰面积的影响，结果见图1。

图1 邻苯二甲醛浓度对γ-氨基丁酸衍生物峰面积的影响Fig.1 Effect of O-phthalaldehyde concentration on the peak area of γ-aminobutyric acid derivative

由图1可知，当OPA衍生剂浓度高于10 mmol/L后，衍生物峰面积并未随OPA衍生剂浓度的增加而明显增加，表明当OPA衍生剂浓度为10 mmol/L时，GABA已基本实现完全衍生化。因此，选取适当衍生剂浓度，既可减少衍生剂用量，又能避免过量衍生剂对色谱分离的影响，同时还能提高灵敏度。因此，选取最适OPA衍生试剂浓度为15 mmol/L。

2.2 衍生时间的影响

在室温条件下，选取同一质量浓度的GABA标准溶液进行衍生化处理，控制反应时间分别为1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min和7 min，以考察衍生时间对峰面积的影响，结果见图2。

图2 衍生时间对γ-氨基丁酸衍生物峰面积的影响Fig.2 Effect of derivatization time on the peak area of γ-aminobutyric acid derivative

由图2可知，在所考察的衍生时间范围内，当衍生时间增加，GABA衍生物的峰面积总体呈现先增加后降低的变化趋势。当衍生时间为1 min时，衍生反应不完全；当衍生时间延长至2 min时，对应GABA衍生物峰面积最大，但由于GABA衍生物不稳定，随着衍生时间的延长，GABA衍生物峰面积快速下降；当延长衍生时间至5 min后，GABA衍生物的峰面积趋于稳定，即GABA衍生物相对稳定。在衍生剂与样品溶液混合后，需要进行过滤、洗针、手动进样等操作，在衍生时间为2 min时，检测灵敏度最高，但时间难以控制，为确保试验建立的方法具有良好的准确性和重现性。因此，选取最适衍生时间为5 min。

2.3 衍生温度的影响

选取同一质量浓度的GABA标准溶液分别在室温、35 ℃、45℃、55℃和65℃下进行衍生化处理，控制反应时间为5min，以考察不同衍生温度对峰面积的影响，结果见图3。

图3 衍生温度对γ-氨基丁酸衍生物峰面积的影响Fig.3 Effect of derivatization temperature on the peak area of γ-aminobutyric acid derivative

由图3可知，在不同衍生温度下对应的GABA衍生物峰面积间有着明显差异。在所考察的衍生温度范围内，当衍生温度升高时，GABA衍生物的峰面积呈下降的变化趋势，说明OPA与GABA的衍生化产物稳定性变差。因此，选取最适衍生化温度为室温。

2.4 检测波长的选择

按照1.3.3方法对GABA标准溶液进行衍生化处理，其衍生物经过C18柱分离后进入二极管阵列检测器在210～400 nm范围内进行光谱扫描，结果见图4。

图4 γ-氨基丁酸生物的紫外光谱扫描结果Fig.4 Ultraviolet spectrum results of γ-aminobutyric acid derivative

由图4可知，GABA衍生物有2个特征吸收峰，分别为228 nm和334 nm。在最佳衍生条件下，设置波长分别为228 nm和334 nm，固定其他色谱条件不变，选取同一样品进行分析检测。与检测波长334 nm相比，尽管228 nm时，色谱图有较多杂峰，但这些杂峰对于GABA的定性与定量分析并无影响，且大幅提高了分析灵敏度。因此，选择最适检测波长为228 nm。

2.5 流动相比例的选择

在上述最佳衍生条件及固定色谱柱温度为30 ℃，且其他色谱条件不变，设置流动相乙腈与20 mmol/L结晶乙酸钠的体积比为23∶77、22∶78、21∶79和20∶80，分别对标准溶液和样品溶液中GABA进行分离分析，考察流动相比例对目标物质与其他成分分离情况的影响，以确定最佳流动相比例，结果见图5。由图5可知，当流动相中乙腈比例从23%变化到19%的过程中，随着乙腈比例的降低，目标物质的保留时间逐渐增长。当流动相A与B比例为23∶77时，样品中杂质与目标物质的色谱峰重叠严重；当流动相A与B比例为22∶78时，目标物质与杂质峰仍不能完全分离；当流动相A与B比例为21∶79时，目标物质可以实现基线分离，且无拖尾现象；当流动相A与B比例为20∶80时，样品中杂质与目标物质的色谱峰完全分离，但分析时间较长。因此，选择流动相乙腈-20 mmol/L结晶乙酸钠最适体积比为21∶79。

图5 乙腈与20 mmol/L结晶乙酸钠体积比对γ-氨基丁酸衍生物峰面积的影响Fig.5 Effect of volume ratio of acetonitrile and 20 mmol/L crystalline sodium acetate on the peak area of γ-aminobutyric acid derivative

2.6 柱温的选择

在上述最佳衍生条件及固定流动相为乙腈-20 mmol/L结晶乙酸钠溶液体积比21∶79，且其他色谱条件不变，设置柱温为25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，分别对标准溶液和样品溶液中GABA进行分析检测，考察柱温对分离效果的影响，以确定最佳柱温条件，结果见图6。

当色谱柱温度为40 ℃和35 ℃时，样品中杂质与GABA衍生物的色谱峰分离效果不佳。当色谱柱温度为30℃和25℃时，目标物质均可以实现基线分离。但由于提高柱温可以缩短分析时间，故选择最适柱温为30℃。30℃条件下样品的HPLC色谱图见图6。由图6可知，在最佳色谱条件下，0.1 mg/mL GABA标准品和乳酸菌发酵液样品的保留时间为11.2 min。

图6 γ-氨基丁酸标准品（a）及乳酸菌发酵液样品（b）的HPLC色谱图Fig.6 HPLC chromatograms of γ-aminobutyric acid standard (a) and lactic acid bacteria fermentation broth sample (b)

2.7 线性关系与检出限

在室温条件下，对1.3.2配制的质量浓度为0.05 μg/mL～0.50 mg/mL的一系列GABA标准溶液进行衍生化处理，按照最佳色谱条件进样，以考察GABA质量浓度与峰面积的线性关系。以GABA质量浓度（x）为横坐标，以峰面积（y）为纵坐标，绘制GABA标准曲线。结果表明，GABA质量浓度在0.05 μg/mL～0.50 mg/mL之间线性关系好（相关系数R2=0.999 4），且线性范围宽，标准曲线线性回归方程为y=66.452x-136.82，检出限为0.02 μg/mL（S/N=3）。

2.8 回收率和精密度的测定

在GABA质量浓度为0.5 μg/mL、5 μg/mL、50 μg/mL3个添加水平下，进行加标回收率和精密度试验，结果见表1。由表1可知，样品的平均加标回收率为91.87%～105.58%，精密度试验结果相对标准偏差（relative standard deviations，RSD）为0.55%～3.74%（n=5）。结果表明，试验建立的方法准确度和精密度良好，分析方法可靠，且适用于乳酸菌发酵液中GABA含量的检测。

表1 加标回收率和精密度试验结果（n=5）Table 1 Results of standard recovery rate test and precision tests (n=5)

2.9 实际样品的测定

按照1.3.1方法对乳酸菌发酵液样品进行制备及处理，按照1.3.3对样品进行衍生化处理，在最佳色谱分析条件下进样检测，并计算发酵液中GABA的含量，结果见表2。由表2可知，所测乳酸菌发酵液样品中均含有GABA，且含量在0.157～0.369 mg/mL之间，表明这几株乳酸菌均具有发酵表达谷氨酸脱羧酶合成GABA的能力。由于GABA的合成与不同菌种、菌株以及发酵培养基条件等有着密切关系，使其合成GABA的含量具有一定差异。结果表明，在最佳色谱条件下，对经衍生处理后的乳酸菌发酵液进行检测，乳酸菌发酵液中目标物质与其他成分具有良好的分离效果，而且该检测方法较文献方法简单[22]、灵敏[23-25]。

表2 不同乳酸菌发酵液样品中γ-氨基丁酸含量Table 2 γ-aminobutyric acid contents in the different lactic acid bacteria fermentation broth samples

3 结论

试验通过考察衍生试剂浓度、衍生时间和衍生温度的影响，检测波长、流动相比例和柱温的优化与选择，建立了一种适用于检测乳酸菌发酵液中GABA的高效液相色谱法，并对实际样品进行测定。结果表明，以OPA作为衍生化试剂，在室温下进行衍生化处理，控制反应时间为5 min，按照检测波长228 nm，流动相为乙腈-20 mmol/L结晶乙酸钠溶液体积比21∶79，柱温30 ℃，流速0.8 mL/min的色谱条件快速进样分析检测，目标色谱峰分离效果好，质量浓度在0.05 μg/mL～0.50 mg/mL之间线性关系好（相关系数R2=0.999 4），且线性范围宽，检出限为0.02 μg/mL，准确度和精密度良好，试验建立的方法简单、灵敏、准确可靠，适用于乳酸菌发酵液中GABA含量的检测，为筛选高产GABA的乳酸菌、优化发酵工艺提供了依据，对提高乳酸菌发酵产品质量具有重要作用。