中医药调控心力衰竭分子机制研究进展

谢许峰,谭颖颖,黄星星,任晓芳

心力衰竭是各种心血管疾病发展到终末期导致的心脏功能衰竭[1]。心力衰竭的发生主要与心肌能量代谢异常、心室重构、心肌纤维化、心肌细胞凋亡等息息相关。其中,心肌能量供给不足或者代谢障碍往往损及线粒体结构和功能,会迫使心肌超负荷工作,从而引发心脏结构及功能受损。而心脏重构是心力衰竭产生和发展的基本机制,心肌纤维化是心脏重构的重要原因,预防和延缓心脏重构已经成为心力衰竭治疗的主要方向[2]。临床上使用最为广泛的强心、利尿和扩血管药物所带来的明显的副作用日益引起关注。而中药因其多通路、多靶点、副作用少的优势,目前在临床和科研中备受期待。本研究系统地整理了中医药从分子生物学角度调控心力衰竭和影响心肌细胞活动的研究现状,以期为中医药临床和实验研究提供更加精准的研究方向,为研究人员提供新思路。

1 中医药调控心力衰竭分子机制

1.1 中医药调控心力衰竭腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)/过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)信号通路 AMPK/PPARα在促进线粒体生物发生和改善衰竭心肌能量代谢方面发挥着重要作用。AMPK 是生物能量代谢的阀门,与线粒体的生物发生有关[3]。PPAR 是核激素受体家族中的配体激活受体,其中,PPARα是该信号通路的下游靶点,与AMPK的表达呈正相关,主要参与脂肪酸的氧化,促进多种脂肪酸代谢酶和基因表达,提高脂肪酸的利用率[4]。心力衰竭发生后,血氧供需异常、线粒体损伤,三磷酸腺苷(ATP)下降,线粒体氧化磷酸化功能异常,AMPK/PPARα表达减少,会进一步加重心力衰竭[5]。另外,本通路可促进葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)基因表达,调控糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)抑制糖原合成,保障心肌能量代谢底物的供给。

实验观察以腹主动脉缩窄法建立舒张性心力衰竭大鼠模型探讨补阳还五汤和酒石酸美托洛尔对心肌能量代谢的影响,研究发现,手术后仅予等离子水的大鼠线粒体数量减少、形态异常,一磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)显著升高,ATP 显著减少,而补阳还五汤、酒石酸美托洛尔两组均可见AMP、ADP 明显减少,而ATP 含量增加,镜下线粒体数量明显增加,形态也得以改善;酶联免疫吸附法(ELISA)结果表明,补阳还五汤与酒石酸美托洛尔对能量代谢的改善可能与两者均可激活舒张性心力衰竭大鼠AMPK 通路,上调PPARα、过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)的表达有关[6],其中,靶标PGC-1α主要参与激活多种与氧化磷酸化有关的基因,促进底物的氧化磷酸化,驱使ATP 的合成[7]。参附强心合剂(组成:人参、附子、桑白皮、猪苓、葶苈子等)和曲美他嗪均可上调心力衰竭大鼠磷酸化AMPK(p-AMPK)、PGC-1α的表达,降低心力衰竭大鼠的血清脑钠肽(BNP)、游离脂肪酸(FFA)、乳酸脱氢酶(LDH)水平,调控葡萄糖转运和脂肪酸氧化代谢,加速心肌能量代谢,其中,高剂量的参附强心合剂在多个方面均可取得与曲美他嗪相当的疗效[8]。

1.2 中医药调控心力衰竭丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路 MAPK 通路作为经典的信号通路,包含细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun 氨基末端激酶(JNK)、p38 MAPK 等多条通路,可调节细胞凋亡、能量代谢,广泛参与心力衰竭、心肌梗死、心肌肥厚等多种心血管疾病的发生[9]。

1.2.1 中医药调控心力衰竭p38 MAPK 信号通路p38 MAPK 主要在细胞质中表达,正常状态下呈低表达,其主要参与基因表达和抗氧化损伤。磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)转移到细胞核内,磷酸化激活转录因子,影响下游多种靶基因[10]。实验证实,麦冬甾体皂苷可诱导p38 MAPK 表达下调,抑制炎性因子白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α),减缓氧化应激[11]。采用腹主动脉缩窄法建立慢性心力衰竭模型后,分别予以等离子水、复方温阳补心汤(组成:制附子、白术、生姜、桂枝、黄芪、当归、茯苓、益母草、川芎、红花)以及琥珀酸美托洛尔。蛋白质印迹法(Western Blot)和ELISA 证明,复方温阳补心汤和琥珀酸美托洛尔均可下调p38 MAPK、p-p38 MAPK 表达,激活过氧化脂质体增殖激活受体-γ(PPAR-γ)通路,促进ATP 表达,减少ADP、N 末端B 型利钠肽前体(NT-proBNP)含量,改善线粒体功能和能量产生缓解心力衰竭[12]。实验探讨心衰康颗粒(组成:红参、熟附子、黄芪、丹参、红花、葶苈子、赤芍、茯苓、车前子等)与卡托普利调控心力衰竭大鼠自噬及其原理时,造模采用结扎左冠状动脉前降支法来复制大鼠慢性心力衰竭模型,通过检测评估大鼠心脏功能、观察心肌组织形态学变化以及检测心肌细胞凋亡和相关通路蛋白表达后发现,心衰康颗粒和卡托普利均可促进心肌细胞形态改善,抑制炎性细胞浸润,抑制细胞凋亡,改善心脏功能相关指数,抑制心肌自噬及凋亡,这与抑制磷酸化ERK(p-ERK)、p-p38 MAPK、微管相关蛋白1 轻链3(LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1 蛋白水平,上调p62 表达有关[13]。保元汤(组成:人参、黄芪、甘草、肉桂等)除了可以抑制氧化应激诱导下的细胞凋亡,还能抑制活性氧(ROS)激活的p38 MAPK-αBcrystallin(CRYAB)通路,保护心肌细胞[14]。

1.2.2 中医药调控心力衰竭ERK 信号通路 ERK 所介导的信号通路是MAPK 众多通路中的1 条,参与细胞的生长、发育及分裂。磷酸化后被激活,发生位置转位,从胞质进入细胞核内介导Ets 样转录因子-1(ELK-1)、转录激活因子(ATF)、c-fos 等活化转录,参与多项生物学活动[15]。三七总皂苷可以改善慢性心力衰竭大鼠心功能,镜下可观察到空白对照组心肌细胞肥大、坏死,心肌纤维排列不规则,炎性细胞浸润,大量心肌细胞凋亡,而三七总皂苷干预下大鼠心肌组织结构完整,心肌细胞肥大得以减轻,心肌纤维排列疏松,血清TNF-α和IL-6 水平也显著下降,其作用机制则可能与下调心肌组织中p-ERK、磷酸化JNK(p-JNK)和p-p38蛋白含量有关[16]。参附益心颗粒(组成:猪苓、人参、附子、益母草、葶苈子、车前子、大枣、泽泻等)、卡托普利、氯沙坦均能下调心力衰竭大鼠心肌中c-fos、c-myc的表达,延缓心肌重塑[17]。

1.3 中医药调控心力衰竭转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad 信号通路 TGF-β1/Smad 信号转导通路与组织纤维化紧密相关,参与心肌成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,并在此过程中促使其产生大量的细胞外基质,抑制金属蛋白酶,促进心肌纤维化。TGF-β1 是目前证实的与组织纤维化最为密切的细胞因子[18]。Smad3蛋白是该通路的下游效应蛋白。

人参皂苷Rb1 及Rg1 可下调心肌组织periostin蛋白和TGF-β表达,抑制TGF-β1/Smad 信号通路引发的心肌纤维化以防治心力衰竭[19]。槲皮素[20]、枸杞多糖[21]均可明显改善慢性心力衰竭大鼠心功能参数,与空白组对照效果显著,镜下观察染色结果可见心肌细胞肿胀明显消退,仅有少量炎性细胞浸润及胶原纤维蛋白沉积,纤维化程度也显著减弱,TGF-β1、Smad3、磷酸化Smad3(p-Smad3)、Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(collagenⅢ)表达明显下降,均表明与TGFβ1/Smad3 信号通路有关。

盐酸肾上腺素(ISO)诱导大鼠心力衰竭造模后,镜下可见其心肌细胞肿胀,界线模糊不清,大量炎性细胞浸润及胶原蛋白沉积。给予不同剂量生脉散干预后,均可下调心肌细胞TGF-β1、p-Samd3 蛋白表达,并且促进左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)升高,左室舒张末内径(LVEDD)、左室收缩末内径(LVESD)降低,染色后观察中低剂量组的心肌细胞基本完整,排列尚为有序,但仍有大量炎性细胞浸润,而高剂量组大鼠心肌细胞结构较中低剂量组完整,炎性细胞浸润及胶原纤维蛋白沉积减少[22]。而分别选用氯沙坦钾以及不同剂量参附益心颗粒治疗心力衰竭大鼠后,3 组都能有效改善心脏功能参数,下调miR-21 mRNA 和TGF-β、Smad3 表达,上调TGF-β受体3 抗体(TGF-βRⅢ)mRNA 表达,其中,高剂量的参附益心颗粒与常规剂量相比,差异有统计学意义[23]。芪丹利心丸(组成:黄芪、党参、刺五加、丹参、葶苈子等)被证实可能通过下调TGF-β1及Smad3 水平,促进抑制剂Smad7 表达,推迟心肌纤维化进展[24]。

1.4 中医药调控心力衰竭核转录因子-κB(NF-κB)信号通路 NF-κB 是细胞内重要的核转录因子,被多条信号通路激活后参与机体的炎症反应、免疫应答,调控细胞凋亡、应激反应。如炎性因子TNF-α、IL-1、脂多糖等介导的经典通路、肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族配体介导的非经典通路以及ROS 催化的Raf1-MAPK 通路;血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的Src/磷酸肌醇-3 激酶(PI3K)信号通路等。在炎性细胞因子的负性肌力作用下,心肌细胞凋亡和心肌成纤维细胞增殖异常,最终会损及心脏。有研究表明,NF-κB 炎症信号通路肩负着抑制炎症反应、延缓心室重构、改善心功能的重大使命[25]。

绿原酸提取自金银花,可上调其抑制剂核因子κB抑制因子α(NF-κBIA)表达,阻滞NF-κB 的核转运功能,抑制ROS,以改善盐酸肾上腺素诱导的心力衰竭大鼠心肌肥大[26]。黄芪甲苷不仅能显著抑制脂多糖诱导的心力衰竭小鼠炎症基因表达,还可以通过抑制Toll 样受体(TLR)4/NF-κB 通路转导,减少心肌细胞凋亡,保护心肌活性[27]。

针对益气温阳方(组成:生黄芪、红景天、制附片、猪苓、葶苈子、莪术、白芍、生姜)对于心力衰竭大鼠作用机制的研究,选用了微创主动脉弓缩窄法(MTAC)制备压力负荷诱导的心力衰竭Wistar 大鼠模型,通过不同剂量益气温阳方治疗后发现,治疗组心肌纤维化明显改善,可能是通过激活IL-10/信号转导与转录激活因子3(STAT3)信号通路,促进相关蛋白表达,并下调NF-κB 表达,抑制炎性因子TNF-α、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等改善心室重构,抑制心肌纤维化及细胞凋亡[28]。黄芪多糖联合丹参酮作用于心力衰竭大鼠后,NF-κB 表达逐渐减少,而抑制剂NF-κB 抑制蛋白(IKB)、IκB 激酶(IKK)活性增强,充分显示了经典途径下的调控效果[29]。

1.5 中医药调控心力衰竭PI3K/蛋白激酶B(Akt)通路 PI3K 隶属胞内磷脂酞肌醇激酶,共有3 类,其中,Ⅰ类的两个亚基p85 和p110 结合后可以产生3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3),进而促使二磷酸肌醇转化为三磷酸肌醇,活化磷酸肌醇依赖的蛋白激酶(PDK)激活细胞内信号蛋白Akt。Akt 磷酸化会影响下游靶基因Caspase-9、Bad、Forkhead、NF-κB、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、P21Par-4、糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)等抑制细胞凋亡,促进细胞生长[30]。葶苈子可抑制神经内分泌系统过度激活,改善心肌纤维化,逆转线粒体病变,恢复线粒体结构,可能与增强Akt 表达及抑制caspase-3、Bax/Bcl-2 有关[31]。红景天苷则可抑制心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌组织中CollagenⅠ、前纤维蛋白-1(Profilin-1)表达,下调磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化GSK3β(p-GSK3β)表达,抑制心肌纤维化[32]。

复心汤(组成:人参、黄芪、茯苓、白术、桂枝、丹参、三七等)可明显下调p-PI3K、p-Akt 表达,增加GSK3β表达来延缓心力衰竭进程[33]。温阳消饮方(组成:附子、干姜、桂枝、茯苓等)通过上调阿奇霉素诱导的心力衰竭大鼠心肌组织中p-PI3K、p-Akt、Bcl-2 等表达,减少Bax、Caspase-8 表达,削弱细胞凋亡,改善心肌损伤[34]。生脉散还可以通过Akt 和ERK1/2 通路减弱氧化应激诱导的心肌细胞损伤[35]。不同剂量的芪苈强心胶囊干预慢性心力衰竭大鼠模型后,心力衰竭大鼠血清中LDH 和ROS 均下降,超氧化物歧化酶(SOD)活性增强,并抑制促凋亡蛋白表达,上调Bcl-2、p-Akt/Akt 和p-GSK3β/GSK3β表达。而细胞实验还证明,过氧化氢(H2O2)损伤心肌细胞H9c2 后,在芪苈强心超微粉干预下24 h 后细胞增殖明显改善,SOD 活性、血红素氧合酶1(HO-1)和过氧化氢酶(CAT)mRNA 表达显著上调,而LDH、ROS、细胞凋亡均被明显抑制。同时,还抑制线粒体分裂、线粒体膜通透性转换孔(mPTP)开放及基质金属蛋白酶(MMP)下降。因此,可以认为芪苈强心胶囊可能通过激活 PI3K/Akt/GSK3β通路减缓氧化应激损伤心肌细胞线粒体依赖性凋亡[36]。

除了中药以外,研究表明,艾灸心力衰竭SD 大鼠双侧心俞穴、肺俞穴,除了可有效抑制MMP-2 和MMP-9 水平,减少心肌细胞自噬,还可以激活PI3K、Akt、mTOR、核糖体蛋白S6 激酶(P70S6K),抑制unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)表达[37]。

1.6 中医药调控心力衰竭Wnt-β-catenin 信号通路Wnt 信号通路涉及多种细胞活动,分为经典与非经典Wnt 通路,经典通路中,Wnt 蛋白结合受体LRP5/6FZD激活下游的β-catenin,继而诱导心肌细胞肥大[38]。非经典通路里,Wnt 蛋白与受体FZD 结合后激活Wnt/Ca2+和Wnt/平面细胞极性(planar cell polarity,PCP)/JNK 信号通路,诱使心肌肥厚发生[39]。Dickkopf-1(DKK1)、分泌型卷曲相关蛋白1(sFRP1)、Wnt 抑制因子-1(WIF1)作为Wnt 信号通抑制剂,通过不同途径阻断Wnt 信号通路转导进而起到保护心脏的作用[40]。

参草通脉颗粒(组成:丹参、人参、黄芪、红花、三七粉、益母草、茯苓、葶苈子)与赖诺普利分别干预冠状动脉结扎造模的慢性心力衰竭大鼠,均可明显升高Wnt3a、Wnt5a、Wnt11 蛋 白 水 平,明 显 下 调DKK1、sFRP1、WIF1 的表达,通过经典与非经典两条通路调节心功能,其中,参麦通草颗粒效果明显优于赖诺普利[41]。补肾活血方(组成:菟丝子、龟板胶、黄精、黄芪、丹参、人参、红花、益母草、三七)可抑制大鼠心肌组织中β-catenin、dishevelled-1(Dvl1)、p-GSK3β、myc mRNA 表达,延缓心肌肥大,优化心肌细胞排列和心室结构[42]。

1.7 中医药调控心力衰竭蛋白激酶C(PKC)信号通路 已知的PKC 家族拥有12 种PKC 同工酶,主要参与细胞功能和信号转导系统,调控细胞的增殖、分化和细胞死亡。有研究表明,PKC 信号通路的过度激活会加速心力衰竭。正常情况下,二酯酰甘油(DAG)直接激活PKC 后,与激活的PKC 的C1 位结合,C2 位结合磷脂酰丝氨酸后转移至细胞膜,在膜磷脂的作用下PDK1 磷酸化PKC 苏氨酸位点,使得PKC 处于激活状态。在此基础上转位结合蛋白激酶C 受体(RACKS),从而起到催化作用。

在高糖环境下建立的心力衰竭乳鼠模型中,心肌细胞PKC 表达增加,白屈菜红碱可以下调PKC-α、PKC-β2表达,维护心肌细胞形态功能[43]。葶苈生脉方(组成:红参、葶苈子、五味子、麦冬、赤芍、生黄芪、益母草、丹参、红花)会抑制AngⅡ1 型(AT1)、PKC 受体表达,从而制约心力衰竭发展[44]。益气活血复方(组成:黄芪、人参、红花、丹参、三七、益母草)可下调SD心力衰竭大鼠AngⅡ和PKC 表达[45]。人参强心滴丸(组成:人参、丹参、生地黄、蟾酥)可抑制慢性心力衰竭大鼠体内AngⅡ含量、AT1 mRNA 和PKC 的过度表达[46]。

2 小结及展望

中医学中对心力衰竭的论述最早可见于《黄帝内经》。譬如《灵枢·胀论》有云:“心胀者,烦心气短,卧不安”,即是指心力衰竭发生时喘息不能平卧的表现。《灵枢·本脏篇》又载:“心小则安,邪弗能伤,易伤以忧”。《灵枢·天年》则曰:“心气始衰,若忧悲,血气懈惰,故好卧”。而《素问》中亦有“心痹者,脉不通,烦则心下鼓,暴上气而喘”“水病下为跗肿大腹,上为喘呼,不得卧者,标本俱病”“夫不得卧,卧则喘者,是水气之客也”等等一系列描述。而张仲景在《金匮要略》首先提出了“心水”一词,而西晋时王叔和所著的《脉经》一书中,其书有云:“心衰则伏,肝微则沉,做令脉伏而沉”。率先提出“心衰”病名。古代医家通过长期临证总结,提出心衰病位在心,为本虚标实之证。气血阴阳虚衰,脏腑功能失司是本,瘀血、痰浊、水饮、气滞痹阻血脉是标。此病经气虚—血瘀—水停不断演化而来,早期以气虚为主,瘀血、痰饮、水湿瘀滞脉络,晚期则阴虚、血瘀并见,因此,在临床治疗中,活血化瘀贯穿始终,兼以益气、化痰、温阳、养阴等。

在慢性心力衰竭病机演化过程中,与心肌纤维细胞增殖、分泌细胞外基质颇为相似。现代医学认为心肌纤维化影响心室重构;而心室重构是发病的病理基础,贯穿疾病始终;炎症细胞浸润、能力代谢障碍参与心力衰竭发展进程,这与中医提出的瘀血、水饮、痰浊不谋而合,为进一步明确中医药治疗机制就需要明确干预的靶点及相关通路。

随着研究的日益精进,中医药在心力衰竭靶点治疗的各个方面取得了一定的成效,也展现了广阔的前景。然而同样也发现了很多问题,如基础实验研究不足;大多数动物造模方式雷同,无法证明各种中医证型下的疗效;除了益气活血中药以外的中医药研究比较少见;缺乏传统中医治法在临床和细胞分子水平的研究,缺少与西药组的疗效比较等。仍需进一步发掘中医药在心力衰竭不同证型、不同研究方向的机制研究,为临床治疗心力衰竭提供更有利的支持。